3 重組人粒細胞刺激因子注射液藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Chongzu Ren Lixibao Cijiyinzi Zhusheye
3.1.3 英文名
Recombinant Human GranulocyteColony-stimulating Factor Injection
3.2 定義、組成及用途
本品系由高效表達人粒細胞集落刺激因子（簡稱人粒細胞刺激因子）基因的大腸桿菌，經發酵、分離和高度純化後獲得的重組人粒細胞刺激因子製成。含適宜穩定劑，不含防腐劑和抗生素。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 工程菌菌種
3.4.1.1 2.1.1 名稱及來源
重組人粒細胞刺激因子工程菌株系由帶有人粒細胞刺激因子基因的重組質粒轉化的大腸桿菌菌株。
3.4.1.2 2.1.2 種子批的建立
3.4.1.3 2.1.3 菌種檢定
3.4.1.3.1 2.1.3.1 劃種LB瓊脂平板
3.4.1.3.2 2.1.3.2 染色鏡檢
3.4.1.3.3 2.1.3.3 對抗生素的抗性
應與原始菌種相符。
3.4.1.3.4 2.1.3.4 電鏡檢查（工作種子批可免做）
虛爲典型大腸桿菌形態，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。
3.4.1.3.5 2.1.3.5 生化反應
3.4.1.3.6 2.1.3.6 重組人粒細胞刺激因子表達量
在搖牀中培養，應不低於原始菌種的表達量。
3.4.1.3.7 2.1.3.7 質粒檢查
3.4.1.3.8 2.1.3.8 目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 種子液製備
將檢定合格的工作種子批菌種接種於適宜的培養基（可含適量抗生素）中培養。
3.4.2.2 2.2.2 發酵用培養基
3.4.2.3 2.2.3 種子液接種及發酵培養
2.2.3.2 在適宜的溫度下進行發酵，應根據經批准的發酵工藝進行，並確定相應的發酵條件，如溫度、pH值、溶解氧、補料、發酵時間等。發酵液應定期進行質粒丟失率檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅸ G）。
3.4.2.4 2.2.4 發酵液處理
用適宜的方法收集、處理菌體。
3.4.2.5 2.2.5 初步純化
採用經批准的純化工藝進行初步純化，使其純度達到規定的要求。
3.4.2.6 2.2.6 高度純化
經初步純化後，採用經批准的純化工藝進行高度純化，使其達到3.1項要求，即爲重組人粒細胞刺激因子原液。加入適宜穩定劑，除菌過濾後於適宜溫度下保存，並規定其有效期。
3.4.2.7 2.2.7 原液檢定
按3.1項進行。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 配製與除菌
3.4.3.1.1 2.3.1.1 稀釋液配製
按經批准的配方配製稀釋液。配製後應立即用於稀釋。
3.4.3.1.2 2.3.1.2 稀釋與除菌
將檢定合格的重組人粒細胞刺激因子原液用2.3.1.1項稀釋液稀釋至所需濃度。除菌過濾後即爲半成品，保存於2～8℃。
3.4.3.2 2.3.2 半成品檢定
按3.2項進行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分裝
應符合“生物製品分裝和凍幹規程”及2010年版藥典三部附錄Ⅰ A有關規定。
3.4.4.3 2.4.3 規格
應爲經批准的規格。
3.4.4.4 2.4.4 包裝
應符合“生物製品包裝規程”及2010年版藥典三部附錄Ⅰ A有關規定。
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 原液檢定
3.5.1.1 3.1.1 生物學活性
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅹ E）。
3.5.1.2 3.1.2 蛋白質含量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B第二法）。
3.5.1.3 3.1.3 比活性
爲生物學活性與蛋白質含量之比，每1mg蛋白質應不低於6.0×107IU。
3.5.1.4 3.1.4 純度
3.5.1.4.1 3.1.4.1 電泳法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度爲15%，加樣量應不低於10μg（考馬斯亮藍R250染色法）或5μg（銀染法）。經掃描儀掃描，純度應不低於95.0%。
3.5.1.4.2 3.1.4.2 高效液相色譜法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B）。色譜柱採用十八烷基硅烷鍵合硅膠爲填充劑；以A相（三氟乙酸－水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻）、B相（三氟乙酸－乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻）爲流動相，在室溫條件下，進行梯度洗脫（0～70%B相）。上樣量應不低於10μg，在波長214nm處檢測，以粒細胞刺激因子色譜峯計算的理論板數應不低於1500。按面積歸一化法計算，重組人粒細胞刺激因子主峯面積應不低於總面積的95.0%。
3.5.1.5 3.1.5 分子量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度爲15%，加樣量應不低於1.0μg，製品的分子質量應爲18.8kD±1.9kD。
3.5.1.6 3.1.6 外源性DNA殘留量
每1次人用劑量應不高於10ng（2010年版藥典三部附錄Ⅸ B）。
3.5.1.7 3.1.7 宿主菌蛋白質殘留量
應不高於蛋白質總量的0.10%（2010年版藥典三部附錄Ⅸ C）。
3.5.1.8 3.1.8 殘餘抗生素活性
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅸ A）。不應有殘餘氨苄西林或其他抗生素活性。
3.5.1.9 3.1.9 細菌內毒素檢查
每300μg蛋白質應小於10EU（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.1.10 3.1.10 等電點
主區帶應爲5.8～6.6，且供試品的等電點圖譜應與對照品的一致（2010年版藥典三部附錄Ⅳ D）。
3.5.1.11 3.1.11 紫外光譜
用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100～500μg/ml，在光路1cm、波長230～360nm下進行掃描，最大吸收峯波長應爲278nm±3nm（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A）。
3.5.1.12 3.1.12 肽圖
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅷ E），應與對照品圖形一致。
3.5.1.13 3.1.13 N端氨基酸序列（至少每年測定1次）
（Met）-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu。
3.5.2 3.2 半成品檢定
3.5.2.1 3.2.1 細菌內毒素檢查
每300μg蛋白質應小於10EU（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.2.2 3.2.2 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.3 3.3 成品檢定
3.5.3.1 3.3.1 鑑別試驗
按免疫印跡法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ A）或免疫斑點法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ B）測定，應爲陽性。
3.5.3.2 3.3.2 物理檢查
3.5.3.2.1 3.3.2.1 外觀
應爲澄明液體。
3.5.3.2.2 3.3.2.2 可見異物
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅴ B），應符合規定。
3.5.3.2.3 3.3.2.3 裝量
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ A），應不低於標示量。
3.5.3.3 3.3.3 化學檢定
3.5.3.3.1 3.3.3.1 pH值
應爲3.5～4.5（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.5.3.3.2 3.3.3.2 滲透壓摩爾濃度
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅴ H）．應符合批准的要求。
3.5.3.3.3 3.3.3.3 重組人粒細胞集落刺激因子含量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ U），應爲標示量的90%～130%。[1]
3.5.3.4 3.3.4 生物學活性
應爲標示量的80%～150%（2010年版藥典三部附錄Ⅹ E）。
3.5.3.5 3.3.5 殘餘抗生素活性
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅸ A）。不應有殘餘氨苄西林或其他抗生素活性。
3.5.3.6 3.3.6 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）．應符合規定。
3.5.3.7 3.3.7 細菌內毒素檢查
每1支應小於10EU（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.3.8 3.3.8 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F小鼠試驗法），應符合規定。
3.6 4 保存、運輸及有效期
於2～8℃避光保存和運輸。自生產之日起，按批准的有效期執行。
3.7 5 使用說明
3.8 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版
4 參考資料
- ^ [1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：2010年版：第二增補本[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010．