2 英文參考
flow cytometry
流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是七十年代發展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學於一體, 同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等,在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。
3 流式細胞術發展簡史
流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的新型分析技術和分選技術。其特點是：①測量速度快，最快可在1秒種內計測數萬個細胞；②可進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數測量，並具有明顯的統計學意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等從多領域的知識和成果；④既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。
概要說來，流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數技術，以及數據的採集和分析技術等。FCM目前發展的水平凝聚了半個世紀以來人們在這方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，並用光電記錄裝置計測的設想，在此之前，人們還習慣於測量靜止的細胞，因爲要使單個細胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細胞和細胞團塊的淤阻。1953年Crosland –Taylor根據雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規律的研究認識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，並具有較強的流體動力聚集作用。於是設計了一個流動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍着鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現代流式細胞術中的液流技術基礎。
1956年，Coulter在多年研究的基礎上利用Coulter效應生產了Coulter 計數器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質之間存在着導電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈衝信號，測量電脈衝的強度和個數則可獲得有關細胞大小和數目方面的信息。1967年Holm等設計了通過汞弧光燈激發熒光染色的細胞，再由光電檢測設備計數的裝置。1973年Steinkamp設計了一種利用激光激發雙色熒光色素標記的細胞，既能分析計數，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現代FCM計數技術的主要歷程。
現代的FCM數據採集和分析技術是從組織化學發源的，其開拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學的基礎上提出了兩個新設想：（1）細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的，即分光光度術可以定量地獲得有關細胞組織化學的重要信息。（2）細胞的不同組分可以同時進行多參數測量，從而可以對細胞進行分類。換句話說，對同一細胞可以同時獲得有關不同組分的多方面信息，用作鑑別細胞的依據。Kamentsky不僅思路敏捷，而且能身體力行。他是第一個把計算機接口接到儀器上並記錄分析了多參數數據的人，也是第一個採用了二維直方圖來顯示和分析多參數的人。
流式細胞術在細胞化學中的應用的先驅者是Van Dilla和美國的Los Alamos小組。他們在1967年研製出流液束、照明光軸、檢測系統光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎上，首次用熒光Feulgen反應對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在着線性關係，並在DNA的直方圖上清楚地顯示出細胞週期的各個時相。Gohde 和Dittrich接着把這項技術推向實用，他們用流式細胞術測定細胞週期藉以研究細胞藥代動力學問題。FCM用於免疫組織化學中的關鍵是對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學的應用並沒有多大差異。
近20年來，國內外在FCM上都做了不少的研究和應用工作，也取得了不少成果。特別是隨着儀器和方法和日臻完善，人們越來越致力於樣品製備、細胞標記、軟件開發等方面的工作以擴大FCM的應用領域和使用效果。FCM在免疫組織化學中的應用也大致差不多，並注重了在臨牀應用的推廣。
4 工作原理
將待測細胞染色後製成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩衝液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞着樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。
流式細胞儀通常以激光作爲發光源。經過聚焦整形後的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。
這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收後可轉換爲電信號，再通過模／數轉換器，將連續的電信號轉換爲可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，液可以打印出來，還可以數據文件的形式存儲在硬盤上以備日後的查詢或進一步分析。
檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸爲測量強度，Y軸爲細胞數目。一般來說，流式細胞儀座標軸的分辨率有512或1024通道數，這視其模數轉換器的分辨率而定。對於雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。
細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電後振動，使噴出的液流斷裂爲均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。
5 檢測範圍
1．流式細胞儀可以檢測細胞結構，包括：細胞大小、細胞粒度、細胞表面面積、核漿比例、DNA含量與細胞週期、R NA 含量、蛋白質含量。
2．流式細胞儀可以檢測細胞功能，包括：細胞表面/ 胞漿/ 核的特異性抗原、細胞活性、細胞內細胞因子、酶活性、激素結合位點和細胞受體。
6 臨牀應用
1．流式細胞術在腫瘤學中的應用：流式細胞術可以檢測腫瘤細胞增殖週期、檢測腫瘤細胞表面標記、癌基因表達產物、進行多藥耐藥性分析、檢測凋亡；
2．流式細胞術在血液學中的應用：檢測白血病和淋巴瘤細胞、活化血小板、造血幹細胞（CD34+）計數、白血病與淋巴瘤的免疫分型、網織紅細胞計數、細胞移植的交叉配型和免疫狀態監測；
8 常規檢測時的樣品製備
8.1 直接免疫熒光標記法
取一定量細胞（約1×106 細胞/ml），直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應（如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入），孵育20～60分鐘後，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入緩衝液重懸，上機檢測。本方法操作簡便，結果準確，易於分析，適用於同一細胞羣多參數同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用於臨牀標本的檢測。
8.2 間接免疫熒光標記法
取一定量的細胞懸液（約1X106 細胞/ml），先加入特異的第一抗體，待反應完全後洗去未結合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原-抗體-抗抗體複合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發後發出的熒光。本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用於科研標本的檢測。但由於二抗一般爲多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結果。所以標本製備時應加入陰性或陽性對照。另外，由於間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數較少的標本。
9 質量控制和注意事項
流式細胞儀並非是完全自動化的儀器，準確的實驗結果還需要準確的人工技術配合，所以標本製備需要規範，儀器本身亦需要質量控制。
9.1 流式細胞術免疫學檢測的影響因素和質量控制
流式細胞術在免疫學中有着廣泛的應用，其免疫熒光染色的標本製備非常重要，常常由於標本製備過程中出現人爲非特異性熒光干擾(尤其在間接免疫熒光染色中)或細胞濃度低等影響檢測結果。解決這些影響因素的方法如下：
(1) 確保標本上機檢測前的濃度爲1X106/ml，細胞濃度過低直接影響檢測結果。
(2) 使用蛋白封閉劑，封閉非特異結合位點，尤其在間接免疫熒光標記時必不可少。常用的蛋白封閉劑爲0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。
(3) 熒光抗體染色後充分洗滌，注意混勻和離心速度，減少重疊細胞和細胞碎片。
(4) 設置對照樣品，採用與抗體來源同型匹配的無關對照和熒光抗體的本底對照。
(5)判定結果時，應注意減去本底熒光，爲使免疫熒光的定量分析更精確，應用計算機程序軟件，用擬合曲線方法從實驗組的曲線峯值中減去對照組的曲線峯值，可以得到更準確的免疫熒光定量結果。
9.2 DNA倍體分析的質量控制
DNA倍體分析的質量控制仍沒有統一的標準， 各文獻報道的實驗結果差異較大，1993年10月美國癌症研究組織制定了FCMDNA定的統一標準，我們根據這些標準並結合國內有經驗的專家多年的實踐，對FCM的DNA分析技術的質控和注意事項進行說明。
(1) 手術切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血壞死組織。
(2) 標本採集後要及時固定或深低溫保存，以免組織發生自溶，DNA降解，而造成測試結果的誤差。
(3) 固定劑要採用對組織細胞穿透性強的濃度，70%的乙醇固定效果較好。
(4) 單細胞懸液製備過程中，注意將待測細胞成分分離出來，減少其他成分的干擾，並注意不要損傷該羣細胞。
(5) 細胞樣品的採集要保證足夠的細胞濃度，即1X106/ml，雜質、碎片、團塊和重疊細胞應<2%，對腫瘤細胞DNA異倍體的分析樣品，至少有20%的腫瘤細胞存在。
(6) 石蠟包埋組織單細胞製備時要注意：取材時應選取無自溶、壞死的組織，對腫瘤組織標本，選取含腫瘤細胞豐富的區域；石蠟組織片的厚度要適宜，最好爲40～50μm 。過薄或過厚的切片均會影響檢測結果；徹底脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性，驗證脫蠟是否完全的方法是棄去二甲苯，加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，說明蠟已脫淨；水化要充分，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態；注意消化的時間和消化酶的活性。常規使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。
9.3 操作
(1)流式細胞儀在整個工作過程中處於最佳狀態，能保證定量檢測的準確性和檢測精度。使用標準樣品調整儀器的變異係數在最小範圍，分辨率在最好狀態，能避免在測量過程中儀器條件的變化引起的檢測誤差。
(2)評價儀器精度的重要指標是儀器的變異係數（CV），對於校準樣品，其CV值越小越好，CV值越小，說明儀器校正的精度越高。校準樣品包括非生物樣品（熒光微球）和生物細胞樣品（人淋巴細胞、雞紅細胞等）。目前，非生物熒光微球已有商品試劑，CV一般<2%～3%。
9.4 資料分析
(1) 當樣品中碎片雜質或團塊過多，所測細胞數在20%以下，組方圖的基線抬高時，應放棄分析處理。
(2) 做細胞週期分析時，樣品細胞數應在1萬個，排除碎片、雜質和團塊，當異倍體細胞數佔總細胞數10%以下時，需要結合其他診斷指標，不可盲目下結論，至少異倍體細胞佔總細胞數的20%以上，可以確定異倍體的存在。
(3)DNA分析時，正常二倍體細胞組方圖CV值>8%時放棄分析，但腫瘤細胞的CV值>8%，與腫瘤細胞的異質性有關。另外，DNA倍體分析時，同源組織的不同個體會出現10%的漂移。
(4)DNA倍體標準的質量控制，採用相同個體同源正常組織、同樣固定方法、相同的樣品處理方法、相同的染色方法、同步染色、同樣的儀器檢測條件、正常的二倍體組織作爲內標準。