3 乙型腦炎減毒活疫苗藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Yixing Naoyan Jiandu Huoyimiao
3.1.3 英文名
Japanese Encephalitis Vaccine,Live
3.2 定義、組成及用途
本品系用乙型腦炎（簡稱乙腦）病毒減毒株接種於原代地鼠腎細胞，經培養、收穫病毒液，加入適宜穩定劑凍乾製成。用於預防乙型腦炎。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 生產用細胞
生產用細胞爲原代地鼠腎細胞或連續傳代不超過5代的地鼠腎細胞。
3.4.1.1 2.1.1 細胞管理及檢定
應符合“生物製品生產檢定用動物細胞基質製備及檢定規程”規定。
3.4.1.2 2.1.2 細胞製備
選用10～14日齡地鼠，無菌取腎，剪碎，經胰蛋白酶消化，用培養液分散細胞，製備細胞懸液，分裝培養瓶，置37℃±1℃培養。細胞生長成緻密單層後接種病毒。來源於同一批地鼠、同一容器內消化製備的地鼠腎細胞爲一個細胞消化批；源自同一批地鼠、於同一天製備的多個細胞消化批爲一個細胞批。
3.4.2 2.2 毒種
3.4.2.1 2.2.1 名稱及來源
生產用毒種爲乙腦病毒SA14-14-2減毒株或其他經批准的減毒株。
3.4.2.2 2.2.2 種子批的建立
原始種子批傳代應不超過第6代，主種子批應不超過第8代，工作種子批應不超過第9代，生產的疫苗應不超過第10代。
3.4.2.3 2.2.3 種子批毒種的檢定
主種子批應進行以下全面檢定，工作種子批應至少進行2.2.3.1～2.2.3.4項撿定。
3.4.2.3.1 2.2.3.1 鑑別試驗
將毒種做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度分別與非同源性乙腦特異性免疫血清和乙腦陰性血清混合，置37℃水浴90分鐘，接種地鼠腎單層細胞或BHK21細胞進行中和試驗，觀察5～7天判定結果。中和指數應大於1000。
3.4.2.3.2 2.2.3.2 病毒滴定
將毒種做10倍系列稀釋，至少取3個稀釋度的病毒液，分別接種BHK21細胞，用蝕斑法進行滴定。凍幹種子批病毒滴度應不低於5.7 lg PFU/ml;液體種子批病毒滴度應不低於7.2 lg PFU/ml。
3.4.2.3.3 2.2.3.3 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.4.2.3.4 2.2.3.4 支原體檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ B），應符合規定。
3.4.2.3.5 2.2.3.5 病毒外源因子檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ C），應符合規定。
3.4.2.3.6 2.2.3.6 E蛋白基因穩定性試驗
以E蛋白基因區核苷酸序列測定驗證其遺傳穩定性。編碼E蛋白基因區的8個關鍵位點氨基酸不能發生改變（E-107：苯丙氨酸，E-138：賴氨酸，E-176：纈氨酸，E-177:丙氨酸，E-264：組氨酸．E-279：甲硫氨酸，E-315：纈氨酸，E-439：精氨酸）。
與基因庫中登錄號爲D90195的乙型腦炎減毒株SA14-14-2株的E蛋白基因區核苷酸序列的同源性應不低於99.6%。
3.4.2.3.7 2.2.3.7 免疫原性檢查
用主種子批毒種製備原疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3個稀釋度，分別免疫體重爲10～12g小鼠10只，每隻皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫後14天用P3株乙腦強毒腹腔攻擊，每隻注射0.3ml,其病毒量應不低於500腹腔滴定的LD50。同時每隻小鼠腦內接種稀釋液0.03ml，接種後3天內死亡者不計（動物死亡數量應不得超過試驗動物總數的20%），攻擊後14天判定結果。ED50應不高於3.0 lg PFU，攻擊對照組小鼠死亡率應不低於80%。
3.4.2.3.8 2.2.3.8 猴體神經毒力試驗
用凍於主種子批進行猴體神經毒力試驗（病毒滴度不低於5.7 lg PFU/ml），分別注射10只恆河猴的兩側丘腦各0.5ml、腰部脊髓內0.2ml。對照組用強毒SA14株稀釋成102PFU/ml和103PFU/ml病毒量，以同法接種恆河猴，每個稀釋度注射4只恆河猴。試驗用恆河猴乙腦抗體應爲陰性。
對SA14-14-2減毒組的10只恆河猴觀察至少21天，應無任何特異性乙腦發病症狀，組織學檢查僅表現爲注射部位、腦和脊髓有輕微的炎症反應。而對照組SAH株在注射後8天內病毒量103PFU/ml組4只恆河猴應全部死亡；病毒量爲102PFU/ml組的4只恆河猴，至少應有2只死亡。組織學檢查表現主要特徵爲神經細胞壞死，較少炎症反應。
3.4.2.3.9 2.2.3.9 腦內致病力試驗
用種子批毒種接種體重爲12～14g小鼠，至少10只，每隻腦內注射0.03ml，觀察14天應存活。接種後3天內死亡者不計（動物死亡數量應不得超過試驗動物總數的20%）。3天后如有小鼠發病，應處死後取腦，測定致病力。小鼠腦內毒力應不高於3.0 lg LD50/0.03ml，同時以10-1病鼠腦懸液皮下注射體重爲10～12g小鼠10只，每隻0.1ml，觀察14天，應全部健存。
3.4.2.3.10 2.2.3.10 皮下感染人腦試驗
用種子批毒種接種體重爲10～12g小鼠10只，每隻皮下注射0.1ml，同時右側腦內空刺，觀察14天，應全部健存。
3.4.2.3.11 2.2.3.11 乳鼠傳代返祖試驗
用病毒滴度不低於7.2 lg PFU/ml（液體毒種）或不低於5.7 lg PFU/ml（凍幹毒種）的種子批毒種接種3～5日齡乳鼠10只，每隻腦內注射0.02ml。將發病的乳鼠處死3只，解剖取腦，用體重爲12～14g小鼠測其致病力，腦內毒力應不高於3.0 lg LD50/0.03ml，同時以10-1的發病乳鼠腦懸液皮下注射體重爲10～12g小鼠10只，每隻0.1ml，觀察14天，應全部健存。
3.4.2.4 2.2.4 毒種保存
毒種應於-60℃以下保存。
3.4.3 2.3 原液
3.4.3.1 2.3.1 細胞製備
按2.1.2項進行。
3.4.3.2 2.3.2 培養液
培養液爲含適量滅能新生牛血清和乳蛋白水解物的Earle's液或其他適宜培養液。用於細胞培養的新生牛血清應爲乙腦抗體陰性。新生牛血清的質量應符合要求（2010年版藥典三部附錄XIII D）。
3.4.3.3 2.3.3 對照細胞病毒外源因子檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ C），應符合規定。
3.4.3.4 2.3.4 病毒接種和培養
挑選生長緻密的單層細胞，用洗滌液充分沖洗後加入適量維持液．按0.001MOI接種病毒，置36℃±1℃培養。
3.4.3.5 2.3.5 病毒收穫
種毒後72小時左右細胞出現病變時收穫病毒液。根據細胞生長情況，可換以維持液繼續培養，進行多次病毒收穫。同一細胞批的同一次病毒收穫液經檢定合格後可合併爲單次病毒收穫液。
3.4.3.6 2.3.6 單次病毒收穫液檢定
按3.1項進行。
3.4.3.7 2.3.7
3.4.3.8 2.3.8
單次病毒收穫液合併同一細胞批的多個單次病毒收穫液檢定合格後，經澄清過濾，合併爲1批原液。
3.4.3.9 2.3.9 原液檢定
按3.2項進行。
3.4.4 2.4 半成品
3.4.4.1 2.4.1 配製
將原液按規定的同一病毒滴度適當稀釋，加入適宜穩定劑即爲半成品，每批半成品總量不得超過150L。
3.4.4.2 2.4.2 半成品檢定
按3.3項進行。
3.4.5 2.5 成品
3.4.5.1 2.5.1 分批
3.4.5.2 2.5.2 分裝及凍幹
應符合“生物製品分裝和凍幹規程”規定。分裝過程中半成品疫苗應置於2～8℃。
3.4.5.3 2.5.3 規格
按標示量復溶後每瓶0.5ml、1.5ml、2.5ml。每1次人用劑量爲0.5ml，含乙腦活病毒應不低於5.4 lg PFU。
3.4.5.4 2.5.4 包裝
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 單次病毒收穫液檢定
3.5.1.1 3.1.1 病毒滴定
按2.2.3.2項進行，病毒滴度應不低於7.0 lg PFU/ml。
3.5.1.2 3.1.2 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.1.3 3.1.3 支原體檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ B），應符合規定。
3.5.2 3.2 原液檢定
3.5.2.1 3.2.1 病毒滴定
按2.2.3.2項進行，病毒滴度應不低於7.0 lg PFU/ml。
3.5.2.2 3.2.2 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.2.3 3.2.3 支原體檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ B），應符合規定。
3.5.2.4 3.2.4 逆轉錄酶活性檢查
3.5.3 3.3 半成品檢定
3.5.3.1 3.3.1 病毒滴定
按2.2.3.2項進行，病毒滴度應不低子6.8 lgPFU/ml。
3.5.3.2 3.3.2 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.4 3.4 成品檢定
除水分測定外，按標示量加入所附疫苗稀釋劑，復溶後進行以下各項檢定。
3.5.4.1 3.4.1 鑑別試驗
按2.2.3.1項進行。
3.5.4.2 3.4.2 外觀
應爲淡黃色疏鬆體，復溶後爲橘紅色或淡粉紅色澄明液體，無異物。
3.5.4.3 3.4.3 水分
應不高於3.0%（2010年版藥典三部附錄Ⅷ D）。
3.5.4.4 3.4.4 病毒滴定
按2.2.3.2項進行，病毒滴度應不低於5.7 lg PFU/ml。
3.5.4.5 3.4.5 熱穩定性試驗
疫苗出廠前應進行熱穩定性試驗，應與病毒滴定同時進行。於37℃放置7天，按2.2.3.2項進行，病毒滴度應不低予5.7 lg PFU/ml，病毒滴度下降應不高於1.0 lg。
3.5.4.6 3.4.6 牛血清白蛋白殘留量
應不高於50ng/劑（2010年版藥典三部附錄Ⅷ I）。
3.5.4.7 3.4.7 抗生素殘留量
生產過程中加入抗生素的應進行該項檢查。採用酶聯免疫法，應不高於50ng/劑；
3.5.4.8 3.4.8 安全試驗
3.5.4.8.1 3.4.8.1 腦內致病力試驗
按2.2.3.9項進行。
3.5.4.8.2 3.4.8.2 乳鼠傳代返祖試驗
按2.2.3.11項進行。
3.5.4.9 3.4.9 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）．應符合規定。
3.5.4.10 3.4.10 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F），應符合規定。
3.5.4.11 3.4. 11 細菌內毒素檢查
應不高於50EU/劑（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E 凝膠限度試驗）。[1]
3.6 4 保存、運輸及有效期
3.7 5 疫苗稀釋劑
疫苗稀釋劑爲滅菌注射用水或滅菌PBS，應符合“凡例”的有關要求。
3.7.1 5.1 滅菌PBS的檢定
3.7.1.1 5.1.1 pH值
應爲7.2～8.0（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.7.1.2 5.1.2 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.7.1.3 5.1.3 細菌內毒素檢查
應不高於0.25EU/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.7.2 5.2 裝量
3.7.3 5.3 包裝
3.7.4 5.4 執行標準
3.7.5 5.5 生產企業
3.7.6 5.6 有效期
3.8 6 附錄
逆轉錄酶活性測定法
3.9 7 使用說明
3.10 附錄 逆轉錄酶活性檢查法
本法系採用PERT法通過以噬菌體MS2 RNA爲模板，在外源逆轉錄酶作用時產生cDNA，再經PCR法擴增後，以電泳法分析擴增產物，檢查供試品中逆轉錄酶活性。
3.10.1 試劑
3.10.1.1 1．噬菌體MS2 RNA寡核苷酸引物
RT-1：5'-d（CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG）-3'
RT-2：5'-d（TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG） -3'
3.10.1.2 2.模板
3.10.1.3 3.逆轉錄體系
（1）模板引物基本反應體系
0.28pmol/μl的噬菌體MS2 RNA 0.5μl
10pmol/μl引物RT-1 0.5μl
焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的水 0.4μl
供試品（或不同靈敏度標準逆轉錄酶或陽性對照、陰性對照） 2μl
2.5mmol/ml脫氧核糖核苷酸（dNTPs） 0.5μl
25mmol/ml氯化鎂 0.5μl
二硫蘇糖醇（DTT） 0.5μl
DFPC處理的水15.1μl至總量爲23.6μl
3.10.1.4 4. PCR擴增體系
PCR緩衝液 10μl
2.5mmol/ml dNTPs 2μl
10pmol/μl引物RT-1 2μl
10pmol/μl引物RT-2 3μl
RNA酶H 1μl
DEPC處理的水至75μl
加入Taq DNA聚合酶0.2μl。
3.10.1.5 5.甲基氨基甲烷－硼酸（TBE）電泳緩衝液
硼酸 27.5g加入0.5mol/L四甲基乙二胺（pH8.0）20ml定容至1000ml，使用時1：5倍稀釋。
3.10.2 供試品、靈敏度標準及陽性對照品的製備
1．按標示量復溶供試品。
2．取1U逆轉錄酶用DEPC處理的水做10倍系列稀釋，取10-6、10-7和10-8稀釋度各2μl作爲靈敏度標準。
4．陰性對照：用2μl DEPC處理的水代替。
3.10.3 檢查法
3.10.3.1 1．逆轉錄
1.1 將模板引物基本反應體系1.4μl依次置於95℃反應5分鐘，37℃反應30分鐘，4℃反應5分鐘後，加入逆轉錄反應體系23.6μl（總體積爲25μl），置37℃作用30分鐘。
1.2 分別將供試品、陽性對照、陰性對照及稀釋度爲10-6～10-8靈敏度標準的逆轉錄酶2μl加入上述逆轉錄反應體系，分別置37℃作用30分鐘。
3.10.3.2 2．PCR擴增
取PCR擴增體系75μl，加入上述經各逆轉錄後的樣品，混勻後，按下列條件進行擴增：94℃30秒，55℃100秒，72℃110秒，共35個循環週期，72℃延伸10分鐘。產物作瓊脂糖凝膠電泳分析，如不能立即進行瓊脂糖凝膠電泳分析．PCR擴增產物應於2～8℃保存。
3.10.3.3 3．PCR擴增產物的電泳
將適量的PCR擴增產物加到2%瓊脂糖凝膠板上進行電泳分析（附錄Ⅳ B），同時加DNA分子量標準，電泳後紫外燈下觀察DNA條帶結果。
3.10.4 結果判定
陽性對照於112bp處呈現條帶，陰性對照不出現任何條帶，供試品於112bp處呈現條帶判爲陽性。
【附註】
【藥品名稱】
通用名稱：乙型腦炎減毒活疫苗
英文名稱：Japanese Encephalitis Vaccine, Live
漢語拼音：Yixing Naoyan Jiandu Huoyimiao
【成分和性狀】
本品系用流行性乙型腦炎病毒減毒株接種原代地鼠腎細胞，經培養、收穫病毒液，加入適宜穩定劑凍乾製成。爲淡黃色疏鬆體，復溶後爲橘紅色或淡粉紅色澄明液體。
【接種對象】
【作用與用途】
接種本疫苗後，可刺激機體產生抗乙型腦炎病毒的免疫力。用於預防流行性乙型腦炎。
【規格】
復溶後每瓶0.5ml、1.5ml、2.5ml。每1次人用劑量爲0.5ml.含乙型腦炎活病毒應不低於5.4 lg PFU。
（2）於上臂外側三角肌下緣附着處皮下注射。
（3）8月齡兒童首次注射1次；於2歲再注射1次，每次注射0.5ml，以後不再免疫。
【不良反應】
常見不良反應：
（1） 一般接種疫苗後24小時內，注射部位可出現疼痛和觸痛，多數情況下於2～3天內自行消失。
（2）一般接種疫苗後1～2周內，可能出現一過性發熱反應。其中大多數爲輕度發熱反應，一般持續1～2天后可自行緩解，不需處理，必要時適當休息，多喝開水，注意保暖，防止繼發感染；對於中度發熱反應或發熱時間超過48小時者，可給予物理方法或藥物對症處理。
（3）接種疫苗後，偶有散在皮疹出現，一般不需特殊處理，必要時可對症治療。
罕見不良反應：
極罕見不良反應：
（1）過敏性皮疹：一般接種疫苗後72小時內出現蕁麻疹，出現反應時，應及時就診，給予抗過敏治療。
（2）過敏性休克：一般接種疫苗後1小時內發生。應及時注射腎上腺素等搶救措施進行治療。
（3）過敏性紫癜：出現過敏性紫癜反應時應及時就診，應用皮質固醇類藥物給予抗過敏規範治療，治療不當或不及時有可能併發紫癜性腎炎。
（4）出現血管神經性水腫，應及時就診。
【禁忌】
（1）已知對該疫苗所含的任何成分，包括輔料以及抗生素過敏者。
（2）患急性疾病、嚴重慢性疾病、慢性疾病的急性發作期和發熱者。
（3）妊娠期婦女。
【注意事項】
（1）以下情況者慎用：家族和個人有驚厥史者、患慢性疾病者、有癲癇史者、過敏體質者、哺乳期婦女。
（3）疫苗瓶有裂紋、標籤不清或失效者、疫苗復溶後出現渾濁等外觀異常者均不得使用。
（4）疫苗瓶開啓後應立即使用，如需放置，應置2～8℃於30分鐘內用完，剩餘均應廢棄。
（5）應備有腎上腺素等藥物．以備偶有發生嚴重過敏反應時急救用。接受注射者在注射後應在現場觀察至少30分鐘。
（6）注射免疫球蛋白者應至少間隔3個月以上接種本品，以免影響免疫效果。
（8）本品爲減毒活疫苗，不推薦在該疾病流行季節使用。
（10）嚴禁凍結。
【貯藏】
於2～8℃避光保存和運輸。
【包裝】
按批准的執行。
【有效期】
18個月。
【執行標準】
【批准文號】
【生產企業】
企業名稱：
生產地址：
郵政編碼：
電話號碼：
傳真號碼：
網 址：
3.11 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版
4 參考資料
- ^ [1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：2010年版：第二增補本[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010．