二代测序
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二代测序
文件:NGS Workflow.jpg
二代测序 (NGS) 标准工作流程：文库构建 $\rightarrow$ 簇生成 $\rightarrow$ 测序 $\rightarrow$ 数据分析。
二代测序（Next-Generation Sequencing，简称 NGS），又称高通量测序（High-Throughput Sequencing），是继 Sanger 测序（一代测序）之后的革命性 DNA 测序技术。
NGS 的核心特征是大规模并行测序（Massively Parallel Sequencing），即能够同时对数百万甚至数十亿个 DNA 分子进行测序。这使得测定一个人类全基因组的成本从 30 亿美元（人类基因组计划时代）降低至 1000 美元以内，极大地推动了肿瘤精准医疗、遗传病诊断和无创产前筛查的发展。
基本信息
| 中文名称 | 二代测序 / 高通量测序 |
|---|---|
| 英文名称 | Next-Generation Sequencing (NGS) |
| 核心原理 | 边合成边测序 (Sequencing by Synthesis) |
| 关键特征 | 大规模并行、高通量、低成本 |
| 主流平台 | Illumina (全球垄断地位), Ion Torrent, MGI (华大智造) |
| 临床应用 | 肿瘤伴随诊断 (Panel)、无创产前筛查 (NIPT)、病原宏基因组 (mNGS) |
技术原理 (以 Illumina 平台为例)
目前的市场主流技术基于“边合成边测序”原理：
- 文库构建 (Library Prep)：将 DNA 打断成小片段（通常 200-500bp），并在两端加上特定的接头（Adapter）。
- 簇生成 (Cluster Generation)：DNA 片段在测序芯片（Flow Cell）上进行桥式 PCR 扩增，形成包含数千个相同拷贝的 DNA “簇”，以增强信号强度。
- 测序 (Sequencing)：加入带有荧光标记的 dNTP。每合成一个碱基，就释放出特定颜色的荧光，光学系统捕获荧光信号，从而读出碱基序列（A/T/C/G）。
- 数据分析：利用生物信息学算法将数亿条短序列（Reads）比对回人类参考基因组，识别变异。
与一代测序 (Sanger) 的对比
| 维度 | 一代测序 (Sanger) | 二代测序 (NGS) |
|---|---|---|
| 通量 | 低 (一次只能测 1-96 个样本) | 极高 (一次可产生 T 级别数据) |
| 原理 | 双脱氧链终止法 | 大规模并行合成测序 |
| 读长 | 长 (800-1000 bp) | 短 (150-300 bp) |
| 准确性 | 金标准 (99.999%) | 较高 (99.9%)，但在重复区域易出错 |
| 主要用途 | 单个基因验证、小片段测序 | 全基因组、全外显子、大 Panel 筛查 |
临床应用场景
1. 肿瘤精准医疗
- 伴随诊断 (Panel)：一次性检测几十到数百个癌症相关基因（如 EGFR, ALK, KRAS, TP53），指导靶向药和免疫治疗（TMB 评估）。
- 液体活检：利用超高深度 NGS（通常 >10000×）检测血液中的 ctDNA，用于 微小残留病 (MRD) 监测。
2. 遗传病与生殖健康
- 无创产前筛查 (NIPT)：通过检测母体血浆中的胎儿游离 DNA，筛查唐氏综合征（21三体）等染色体异常。
- 全外显子测序 (WES)：诊断罕见遗传病。
3. 感染病原检测 (mNGS)
- 宏基因组测序：不依赖培养，直接对样本中所有核酸进行测序，能快速识别疑难危重感染中的病毒、细菌、真菌或寄生虫。
局限性
- 读长较短：难以处理复杂的基因组结构变异（如大片段倒位、易位）或高重复区域。这方面正逐渐被三代测序（长读长测序，如 PacBio/Nanopore）所补充。
- 数据分析复杂：海量数据需要昂贵的计算资源和专业的生物信息学团队进行清洗、比对和注释。
- 扩增错误：PCR 过程可能引入偏差（Bias），影响定量准确性（需通过 UMI 技术校正）。
参考文献
- [1] Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet. 2010.
- [2] Goodwin S, et al. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016.
- [3] Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 2008.