PCR
PCR（聚合酶链式反应）是由 凯利·穆利斯（Kary Mullis）于 1983 年发明的一种分子生物学技术，被誉为生物技术的“复印机”。该技术模拟体内 DNA 复制过程，通过 温度循环 诱导 DNA 的体外变性、退火与延伸，从而在数小时内将特定 DNA 片段扩增至数百万倍。PCR 是现代生命科学、临床医学及法医学的基石，不仅是 病原体检测 和 基因组学研究 的金标准，更是 液体活检（如 ctDNA 检测）及 NGS 文库构建中不可或缺的前处理技术。
生化原理：三步热循环的逻辑
PCR 的成功依赖于精准的温度切换，每一步都对应着 DNA 分子的物理化学变化：
- 变性 (Denaturation)： 加热至约 95 摄氏度。高温破坏 DNA 双链间的氢键，使其解离为单链模板。
- 退火 (Annealing)： 降温至 50 到 65 摄氏度。特异性 引物 根据碱基互补配对原则结合在模板 DNA 的两侧。
- 延伸 (Extension)： 升温至 72 摄氏度。耐热的 Taq聚合酶 以 dNTPs 为原料，从引物末端沿 5 到 3 方向合成互补链。
- 指数扩增： 经过 n 次循环后，目标 DNA 序列的理论拷贝数为起始浓度的 2 的 n 次方。
临床应用：从病原诊断到伴随诊断
PCR 技术在临床实践中已演化出多种高灵敏度工具，满足不同场景的诊断需求：
| 技术亚型 | 技术特征 | 典型临床场景 |
|---|---|---|
| qPCR (定量) | 利用荧光探针实时监测扩增曲线。 | 病毒载量 监测 (如 HBV, HIV), 基因表达定量。 |
| RT-PCR (逆转录) | 先将 RNA 转为 cDNA，再进行扩增。 | RNA 病毒检测, 肿瘤 融合基因 (如 ALK) 筛查。 |
| ddPCR (数字) | 样本微液滴化，实现绝对定量。 | 稀有突变检测, ctDNA 微量监测, 拷贝数变异。 |
技术挑战与质量控制策略
- 污染风险 (Carry-over)： 由于 PCR 极高的灵敏度，微量的环境污染即可导致假阳性。临床实验室需严格执行 分区操作 规范。
- 引物特异性： 错误的引物设计会导致非特异性扩增。利用 人工智能引物设计 和 BLAST 比对是确保准确性的前置步骤。
- 扩增抑制物： 样本中的血红蛋白、肝素等物质会抑制 聚合酶 活性。高质量的 DNA 提取步骤是 PCR 成功的保障。
关键关联概念
- Taq聚合酶： 来自水生栖热菌的热稳定性 DNA 聚合酶，使 PCR 自动化成为可能。
- 引物： 决定扩增特异性的关键短核苷酸序列。
- Ct值： 实时荧光定量 PCR 中反映起始模板浓度的核心指标。
- 热循环仪： 精确执行 PCR 温度升降的专用硬件平台。
学术参考文献与权威点评
[1] Mullis K, et al. (1987). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Methods in Enzymology.
[学术点评]：诺贝尔奖得主克利·穆利斯的奠基性论文，详述了 PCR 的基本构想。
[2] Saiki RK, et al. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences for diagnosis of sickle cell anemia. Science.
[学术点评]：首次展示了 PCR 在人类遗传病精准诊断中的巨大临床潜力。
[3] Bustin SA, et al. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry.
[学术点评]：确立了 qPCR 实验的标准化指南，对临床检测的可靠性至关重要。