高通量测序
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高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS），又称**下一代测序**（Next-Generation Sequencing, **NGS**），是一种能够一次性并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术。与传统的Sanger测序相比，HTS通过**大规模并行测序**（Massively Parallel Sequencing）策略，极大地降低了测序成本并提高了产出通量。该技术是现代**精准医疗**的基石，特别是在肿瘤基因突变检测、**新抗原**发现及**细胞治疗**产品的质控中扮演核心角色。
技术迭代：从“读长”到“通量”的博弈
测序技术的发展经历了三个主要阶段，每一代都在读长、通量和准确性之间寻找不同的平衡点：
| 代际 | 核心原理 | 优势 (Pros) | 局限 (Cons) |
|---|---|---|---|
| **第一代 (Sanger)** | 双脱氧链终止法 | **金标准**，准确率极高 (99.99%)，读长较长 (800-1000bp)。 | 通量低，成本高，难以进行全基因组分析。 |
| **第二代 (NGS)** | **边合成边测序 (SBS)** 桥式PCR扩增 |
**超高通量**，成本大幅降低，适合大规模变异筛查与定量分析。 | 读长短 (PE150)，难以解析复杂结构变异 (SV) 和高重复区域。 |
| **第三代 (TGS)** | 单分子实时测序 (SMRT) 纳米孔测序 |
**超长读长** (10kb-Mb)，无需扩增，可直接检测甲基化。 | 单碱基错误率相对较高（通过HiFi模式已大幅改善）。 |
临床肿瘤学与细胞治疗中的应用
在精准医疗领域，HTS不仅仅是检测工具，更是治疗策略的决策依据。
- **新抗原 (Neoantigen) 筛选**：
- 对于**mRNA肿瘤疫苗**和个性化细胞治疗，HTS通过对肿瘤组织（WES/WGS）和RNA（RNA-seq）进行测序，结合HLA分型，运用算法预测具有高免疫原性的突变肽段。这是实现“千人千药”的关键步骤。
- **微小残留病灶 (MRD) 监测**：
- 利用超高深度的NGS技术检测血浆中的循环肿瘤DNA (**ctDNA**)。相比影像学，MRD能提前3-6个月发现复发迹象，指导术后辅助治疗的升降级。
- **免疫组库 (TCR/BCR Repertoire)**：
- 通过扩增CDR3区域进行测序，分析T细胞克隆的多样性与动态变化。在评估PD-1/PD-L1治疗响应及**CAR-T**细胞在体内的扩增持久性方面具有重要价值。
流程概览
[Image of NGS sequencing workflow]
1. **文库构建 (Library Prep)**：将DNA/RNA打断，加接头 (Adapter) 和索引 (Index)。
2. **成簇扩增 (Cluster Generation)**：在流动槽 (Flow Cell) 上将单分子DNA扩增成信号簇（Illumina平台）。
3. **测序 (Sequencing)**：捕获荧光信号或电信号，转化为碱基序列。
4. **数据分析 (Bioinformatics)**：
* **Base Calling**：将光信号转为FASTQ文件。 * **Mapping**：比对到人类参考基因组 (如hg38)。 * **Variant Calling**：识别SNV, InDel, CNV, SV等变异。
参考文献
- [1] **Shendure J, Ji H**. **Next-generation DNA sequencing.** *Nature Biotechnology*. 2008.
- 【评析】**：综述了NGS技术的早期发展与核心原理，标志着基因组学进入高通量时代。
- [2] **Campbell PJ, et al**. **Pan-cancer analysis of whole genomes.** *Nature*. 2020.
- 【评析】**：ICGC/TCGA全基因组泛癌分析计划（PCAWG）的里程碑式成果，展示了WGS在解析肿瘤复杂性中的威力。
- [3] **Schumacher TN, Schreiber RD**. **Neoantigens in cancer immunotherapy.** *Science*. 2015.
- 【评析】**：阐述了基于NGS发现的肿瘤新抗原如何驱动T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，是免疫治疗的重要理论基础。