1 拼音
fā guāng miǎn yì jì shù
發光免疫技術是將發光系統與免疫反應相結合，以檢測抗原或抗體的方法。其既具有免疫反應的特異性，更兼有發光反應的高敏感性，在免疫學檢驗中應用日趨廣泛。
2 發光的基本知識
一種物質由電子激發態回覆到基態時，釋放出的能量表現爲光的發射，稱爲發光（luminescence）。發光可分爲三種類型：光照發光、生物發光和化學發光。
1．光照發光（photoluminescence）發光劑經短波長入射光照射後進入激發態，當回覆至基態時發出較長波長的可見光（見第十七章）。
2．生物發光（bioluminescence）典型例子爲螢火蟲發光。反應底物爲螢火蟲光素（fireflyluciferin），在熒光素酶（luciferase）的催化下利用ATP產能，生成激發態的氧化熒光素（oxyluciferin），後者在回覆到基態時多餘的能量以光子形式放出。反應式如下：
3．化學發光（chemiluminescence）在常溫下由化學反應產生的光的發射。化學發光是一個多步驟的過程，其機制爲某些化合物（發光劑或發光底物）可以利用一個化學反應產生的能量使其產物分子或反應中間態分子上升至電子激態。當此產物分子或中間態分子衰退至基態時，以發射光子的形式釋放能量（即發光）。
3 化學發光底物
在化學發光反應中參與能量轉移並最終以發射光子的形式釋放能量的化合物稱爲化學發光劑或發光底物。在發光免疫技術中常用的化學發光底物有以下幾類。
1．氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學發光劑。魯米諾（luminol，5＇-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結構及化學反應式如下：
魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物。異魯米諾衍生物ASEI和ABMI等也是常用的標記物。
2．吖啶酯（acridiniumester，AE）類這類發光劑不需催化劑的存在，在有過氧化氫的稀鹼溶液中即能發光。反應式如下：
圖18-1 電化學發光原理
上式反應迅速，在1～5s內即可完成；具有背景低、信比高的優點，其檢測極限可達5×10-9mol，發光量與AE濃度呈良好的線性反應，是一類的標記物。
3．電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）反應在電極表面進行。發光底物爲三聯吡啶釕[Ru（bpy）32+]，另一反應物爲三丙胺（TPA）。在陽電極表面，以上兩化學物質可同時失去電子發生氧化反應（圖18-1）。二價的Ru（bpy）32+被氧化成三價Ru（bpy）33+，TPA被氧化成陽離子自由基TPA+●，後者失去一個質子（H+），成爲自由基TPA●，這是一個強還原劑，可將一個電子遞給三價的Ru（bpy）32+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化產物。激發態的Ru（bpy）32+*在衰減時發射一個波長爲620nm的光子，重新生成基態的Ru（bpy）32+。這一過程在電極表面週而復始地進行，產生許多光子，使信號得以增強。化學發光免疫測定
化學發光反應參與的免疫測定分爲二種類型。第一種是以發光劑作爲酶免疫測定的底物，通過發光反應增強測定的敏感性；第二種是以發光劑作爲抗體或抗原的標記物，直接通過發光反應檢測標本中抗原或抗體的含量。
4 化學發光酶免疫測定
從標記免疫測定來看，化學發光酶免疫測定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA）應屬酶免疫測定。測定中2次抗原抗體反應步驟均與酶免疫測定相同，僅最後一步酶反應所用底物爲發光劑，通過化學發光反應發出的光在特定的儀器上進行測定。兩種常用的標記酶，辣根過氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶（AP）均有其發光底物，由此建立的CLEIA均在臨牀檢驗中應用。
4.1 HRP標記的CLEIA
常用的底物爲魯米諾或其衍生物。魯米諾的氧化反應在鹼性緩衝液中進行，通常以0.1mol/LpH8.6Tris緩衝液作底物液，魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發發光，而在最後光強度測定中造成空白干擾，因而宜分別配製成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。
HRP催化魯米諾氧化的反應可被某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲熒光素酶等加強。加強劑的作用是增強發光和延長髮光時間，由此可提高敏感度。
4.2 AP標記的CLEIA
在以AP爲標記酶的CLEIA中，應用的底物爲adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品試劑如PPD可供應用。發光反應的反應式如下：
5 化學發光標記免疫測定
化學發光標記免疫測定亦稱化學發光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLIA），是用化學發光劑直接標記抗原或抗體的一類免疫測定方法。用作標記的化學發光劑應符合以下幾個條件：①能參與化學發光反應；②與抗原或抗體偶聯後能形成穩定的結合物試劑；③偶聯後仍保留高的量子效應和反應動力；④應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。魯米諾類和吖啶酯類發光劑等均是常用的標記發光劑。
魯米諾類的發光反應須有催化劑（例如過氧化物酶）催化，且與蛋白質或肽結合後其發光作用減弱，因此魯米諾類在CLEIA中是很好的底物，但已較少用於CLIA的標記。吖啶酯類對CLIA更爲適用，其顯著的優點是：①氧化反應不需催化劑，只要鹼性環境中就可以進行。反應物在加入H2O2後再加氫化鈉溶液，發光反應迅速，本底低。②在氧化反應過程中，結合物被分解，因此遊離的吖啶酯的發光不受抑制。試劑穩定性好。
6 電化學發光免疫測定
在電化學發光免疫測定（electrochemluminescenceimmunoassay，ECLI）中應用的標記物爲電化學發光反應的底物三聯吡啶釕，其衍生物N-羥基琥珀酰胺（NHS）酯可通過化學反應與抗體或不同化學結構的抗原分子結合，製成標記的抗體或抗原。ECLI的測定模式與ELISA相似，分二個步驟進行。以雙抗體夾心法測定抗原爲例，第一步在試管中進行，反應物爲Ru（bpy）32+標記的抗體、吸附在磁性微球上的固相抗體以及受檢的標本，反應式如圖18-2。
圖18-2 ECLI中的抗原抗體反應
反應後除由標記抗體、固相抗體與標本中的抗原形成的夾心複合物外，尚有多餘的標記抗體和固相抗體。第二步是將反應液輸入特殊的檢測儀器的反應室中（圖18-3），隨即用含三丙胺（TPA）的緩衝液沖洗。反應室電極下有磁鐵。含磁性微球的夾心複合物及遊離的固相抗體被吸附在電極表面，遊離的標記抗體隨沖洗液流出。此時在反應室中即發生如圖18-1的電化學發光反應。發出的光由光電倍增管轉爲信號，通過電信號的測定反映標本中抗原的含量。
圖18-3 ECLI中的ECL反應
ECLI具有以下優點：①標記物在再循環利用，使發光時間更長、強度更高、易於測定；②敏感度高，可達pg/ml或pmol水平；③線性範圍寬，＞104；④反應時間短，20min以內可完成測定；⑤試劑穩定性好，2～5℃可保持一年以上。