3 英文翻譯
Polyclone antibodies preparation technique
4 概述
4.1 多克隆抗體的概念
抗原刺激機體，產生免疫學反應，由機體的漿細胞合成並分泌的與抗原有特異性結合能力的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結合能力的免疫球蛋白就是抗體。
抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細胞接受該抗原所產生的抗體稱之爲單克隆抗體（Monclone antibody）。由多種抗原決定簇刺激機體，相應地就產生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機體內所產生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇，也可刺激機體產生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。
4.2 免疫動物
供免疫用的動物主要是哺乳動物和禽類，常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動物的選擇常根據抗體的用途和量來決定，也與抗原的性質有關。如要獲得大量的抗體，多采用大動物；如要是獲得直接標記診斷的抗體，則直接採用本動物；如要獲得間接的標記診斷用抗體，則必須用異源動物製備抗體；如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以採用純系小鼠製備；一般實驗室採用的抗體，多用兔和羊製備。
免疫用的動物最好選擇適齡的健康雄性動物，雌性動物特別是妊娠動物用於製備免疫抗體則非常不合適，有時甚至不產生抗體。由於對免疫應答的個別差異，免疫時應同時選用數只動物進行免疫。
抗原是多種多樣的，而且千差萬別。就其化學成分而言，有蛋白質抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。爲了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質抗原，如要製備用於篩選細菌表達的cDNA文庫或免疫印跡的抗血清，最好選用可降解的蛋白質抗原。不同的抗原，其免疫原性的強弱均不相同，這種免疫原性的強弱取決於抗原的分子量、化學活性基團、立體結構、物理形狀和彌散速度等。
抗原的免疫劑量是依照給予動物的種類、免疫週期以及所要求的抗體特性等不同而不同。劑量過低，不能引起足夠強的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的範圍內，抗體的效價是隨注射劑量的增加而增高。蛋白質抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般而言，小鼠的首次免疫劑量爲50μg～400μg/次，大鼠爲100μg～1 000μg／次，兔爲200μg～1 000μg/次。加強計量爲首次劑量的1／5～2／5。
免疫劑量與注射途徑有關，一般而言，靜脈注射劑量大於皮下注射，而皮下注射又比掌內和蹠內皮下注射劑量大，也可採用淋巴結內注射法。加佐劑比不加佐劑的注射劑量要小，對家兔而言，採用弗氏完全佐劑，則需注射0.5mg～1mg/kg./次，如採用弗氏不完全佐劑則注射劑量應大10倍以上。如要製備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法。如需要獲得高效價的抗血清，宜採用大劑量長程免疫法。免疫週期長者，可少量多次。免疫週期短者，應大量少次。
兩次注射的間隔時間應長短適宜,太短起不到再次反應的效果，太長則失去了前一次激發的敏感作用。一般間隔時間應爲5~7天，加佐劑者應爲2周左右。
注射的Ig純度高，則一般不易引起過敏反應，如注射血清，即使是少量，在再次免疫時，極易引起過敏反應，所以一定要採取措施。
4.3 佐劑的應用
對可溶性抗原而言，爲了增強其免疫原性或改變免疫反應的類型、節約抗原等目的，常採用加佐劑的方法以刺激機體產生較強的免疫應答。
1．佐劑的類型 目前實踐中常應用的佐劑有氫氧化鋁膠、明礬、弗氏佐劑、脂質體和石蠟油等。也有采用結合桿菌等分枝桿菌、白喉桿菌以及細小棒狀桿菌等。
⑴ 弗氏不完全佐劑（incomplete Freund's adjuvant,IFA）
羊毛脂 1 份
石蠟油 5 份
混合，高壓滅菌後保存。用時加熱融化，冷卻至50℃左右，加抗原進行乳化處理。
⑵ 弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvant,CFA）
弗氏不完全佐劑 10ml
卡介苗 10mg～200mg
卡介苗可100℃10min滅活處理。
初次免疫時，最好用弗氏完全佐劑，以刺激機體產生較強的免疫反應。再次免疫時，一般不用完全佐劑，而採用弗氏不完全佐劑。但在研究分枝桿菌及相關抗原時，一般不用弗氏完全佐劑，以免卡介苗的干擾。
⑶ 脂質體：是人工製備的類脂質的小球體，由一個或多個酷似細胞膜的類脂雙分子層組成，這種結構使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性物質，他們被包裹在脂質體內部的水相中，或插入類脂雙分子層或吸附、聯接在脂質體的表面，起到明顯的免疫增強作用。
⑷ 油佐劑 ：採用植物油和礦物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。目前應用最廣的礦物油。
10號白油(石蠟油) 100ml
硬脂酸鋁 2g
司本80 6ml
混合加熱融化，分裝。用時按下列配方進行乳化。
油相 3份
水相（加4%吐溫－80） 1份
先把油相攪拌起來，然後緩慢加入水相乳化。司本是油分散劑，吐溫是水分散劑，均有利於乳化。
2．乳化 將抗原與佐劑混合的過程稱爲乳化。乳化的方法很多，可採用研鉢乳化；可直接在旋渦振盪器上乳化；可用組織搗碎器乳化。少量時，特別是弗氏佐劑與抗原乳化時，常採用注射器乳化，用兩個注射器，一個吸入抗原液，一個吸入佐劑，兩注射器頭以膠管連接，注意一定紮緊，然後來回抽吸。當大量乳化時，可採用膠體磨進行。
乳化好的標誌是取一滴乳化劑滴入水中呈現球形而不分散。如出現平展擴散即爲未乳化好。乳化過的物質放置一段時間（在保存期內）出現油水分層也是未乳化好的表現。
根據抗原的性質、免疫原性和動物的免疫反應性來決定免疫途徑、免疫次數和間隔時間等。
免疫途徑包括皮下注射、皮內注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射以及淋巴結內注射等。抗原量少，則一般多采用加佐劑，淋巴結內或淋巴結周圍、或足掌、或皮內、皮下多點注射，如抗原量多，則可採用皮下、肌肉、以至靜脈注射。
注射間隔時間 帶佐劑的皮內、皮下注射，一般爲間隔2～4周免疫一次。不帶佐劑的皮下或肌肉注射，一般爲1～2周間隔時間；肌肉或靜脈免疫的，可5天左右的間隔時間。
可以把各種注射途徑聯合起來應用，最終以達到效價要求爲目的。
4.4 抗體的鑑定
1.抗體的效價鑑定 不管是用於診斷還是用於治療，製備抗體的目的都是要求較高效價。不同的抗原製備的抗體，要求的效價不一。鑑定效價的方法很多，包括有試管凝集反應、瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗等。常用的抗原所製備的抗體一般都有約成的鑑定效價的方法，以資比較。如製備抗抗體的效價，一般就採用瓊脂擴散試驗來鑑定。
2.抗體的特異性鑑定 抗體的特異性是指與相應抗原或近似抗原物質的識別能力。抗體的特異性高，它的識別能力就強。衡量特異性通常以交叉反應率來表示。交叉反應率可用競爭抑制試驗測定。以不同濃度抗原和近似抗原分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率，求出各自在IC50時的濃度，並按下列公式計算交叉反應率。
如果所用抗原濃度IC50濃度爲pg/管，而一些近似抗原物質的IC50濃度幾乎是無窮大時，表示這一抗血清與其他抗原物質的交叉反應率近似爲0，即該血清的特異性較好。
3.抗體的親和力 是指抗體和抗原結合的牢固程度。親和力的高低是由抗原分子的大小、抗體分子的結合位點與抗原決定簇之間立體構型的合適度決定的。有助於維持抗原抗體複合物穩定的分子間力有氫鍵、疏水鍵、側鏈相反電荷基因的庫侖力、範德華力和空間斥力。親和力常以親和常數K表示，K的單位是L/mol，通常K的範圍在108～1010/mol，也有多達1014/mol。抗體親和力的測定對抗體的篩選，確定抗體的用途，驗證抗體的均一性等均有重要意義。
4.5 抗血清的凍存
抗血清收穫後，加1/萬硫柳汞或1/萬的疊氮鈉防腐，或加入等量的中性甘油，分裝小瓶，置-20℃以下的低溫保存，數月至數年內抗體效價無明顯變化。注意避免反覆凍融。也可將抗血清冷凍乾燥後保存。
5 抗Ig抗體的製備
5.1 抗原製備
Ig是免疫球蛋白，對異種動物而言，是良好的抗原物質。可以刺激異種動物產生抗Ig血清，經適當提取後，產生抗Ig抗體，又叫第二抗體或抗抗體。在多數的間接標記反應中，均需製備抗Ig抗體。
5.2 材料與試劑
1．提取的動物Ig
4．實驗動物 兔
5．其它材料及試劑
5.3 操作方法
（1）淋巴結注射法：①在兔的兩後足蹠部皮下（或皮內）注射活卡介苗50mg（每側約0.30ml）。7～10天后，兔蹠及膕肌淋巴結腫大；②於腫大的兩側淋巴結內各注射加有完全佐劑的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青黴素1 000U/ml、鏈黴素1 000μg/ml)；③必要時，14天后，重複步驟②一次；④再過7天后，於兩側淋巴結內各注射加有完全佐劑的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青黴素1 000U/ml、鏈黴素1 000μg/ml）；⑤5～7天后，耳靜脈採血。測定血清效價。
（2）皮下多點注射法：①家兔兩側掌（蹠內各注射含有完全佐劑抗原0.10ml（IgG含量5mg/ml）；②7～10天后，脊柱兩側多點（頸、胸、腰椎各兩點、共6點）皮下注射含不完全佐劑的抗原，每點0.50ml；③7～10天后，脊柱兩側重複注射一次；④7～10天后試血。不合格者重複步驟③。
（3）多途徑聯合注射法：①兩側掌（蹠）內側皮下注射含完全佐劑抗原0.50ml（IgG量爲5mg/ml）；②14天后，多點皮下注射含有不完全佐劑抗原；③7天后，耳靜脈注射不含佐劑的抗原2ml；④測定血清抗體效價，不合格者重複步驟③，並適當遞增IgG量。
⑴ 將血清倍比稀釋，加入外周孔。
⑵ 中間孔加動物Ig。
⑶ 37℃溼盒瓊擴24小時，觀察結果。
5.4 結果判定
1．抗Ig的效價測定 瓊脂擴散效價達1﹕16或1﹕32者爲合格。
2．純度鑑定 採用瓊擴法。中間孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和標準品Ig。在抗Ig與Ig以及標準品Ig均出現一條沉澱線，且這兩條沉澱線相互融合者，說明提取的Ig是純的。
6 豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯血清的製備
6.1 材料及試劑
4．肥豬
6.2 操作方法
1．基礎免疫 選健康的育肥豬數頭，進行豬瘟、豬丹毒和豬肺疫三種疫苗的基礎免疫。豬瘟疫苗採取肌肉注射法，豬丹毒和豬肺疫採用口服法進行。
2．加強免疫 基礎免疫後7~10天，進行加強免疫。豬瘟疫苗、豬丹毒和豬肺疫菌苗分別爲200頭份、100頭份和100頭份，肌肉或皮下注射。
4．10～12天后，無菌放血和收集血液。放血前一天晚上停食，可飲水。
5．血液自然凝固、分離血清。按0.3%加石炭酸，無菌分裝，冰箱內保存。
6.3 結果判定
2．無菌檢查 採血清樣進行普通肉湯、瓊脂斜面、肝片肉湯，觀察3～7天，應無菌生長。
7 雞新城疫和雞傳染性法氏囊炎二聯高免卵黃抗體的製備
7.1 材料與試劑
3．傳染性法氏囊炎弱毒苗
4．健康產卵雞羣
5．新城疫血凝抗原
7．其它
7.2 操作方法
1．傳染性法氏囊炎組織滅活苗的製備 將有病變的法氏囊組織稱重，以組織搗碎器搗成勻漿，按1︰5（重量︰體積）加滅菌生理鹽水，繼續搗勻，然後用5層滅菌紗布過濾，加入0.30％的甲醛，混勻，37℃感作24h，中間振盪數次。滅活後，以常規培養基進行雜菌檢查，以小白鼠進行安全檢查，合格後，置陰涼處備用。
2．傳染性法氏囊炎滅活油佐劑組織苗的製備 將10號白油按2％加硬脂酸鋁粉和6％的司本－80混合加熱融化後，分裝保存。滅活組織液以4％比例加入吐溫80，以油相︰水相＝3︰1的劑量製成滅活油佐劑組織苗。先將油相攪拌起來，逐漸加入水相，充分攪拌即可。
3．選取健康無主要傳染病，特別是無雞白痢、沙門氏菌病的高產雞羣。
4．將雞新城疫滅活油佐劑苗與傳染性法氏囊炎滅活油佐劑組織苗等量混合，給每隻雞皮下注射2ml。
5．14天后，從雞翅靜脈採血，採集血清做雞新城疫血凝抑制試驗和傳染性法氏囊瓊脂擴散試驗。血凝抑制價平均達到1︰2084，瓊擴效價達到1︰16以上，即爲合格。如不合格，可繼續重複步驟4。
6．效價合格，收穫雞蛋。
7．將雞蛋水洗後，浸入0.50％石炭酸水中消毒半小時，撈出後，置無菌室紫外線照射20min。無菌操作去蛋皮，收取卵黃，按1︰1加入滅菌的含1％石炭酸生理鹽水，攪拌，以兩層紗布過濾，濾液即爲雞新城疫和傳染性法氏囊炎二聯高免卵黃抗體。
8．4℃～8℃保存備用。
7.3 結果判定
1．物理性狀 呈均一的橙黃色帶膠狀的液體，放置一定時間，下沉多量的黃白色絮狀沉澱，搖勻後，仍呈均一黃色或淡白色液體。
2．效價 新城疫血凝抑制價應大於1024×，傳染性法氏囊炎瓊擴效價應大於8×。
3．安全檢查 取3ml～5ml卵黃液一次皮下注射小白鼠或雛雞，無任何影響。
5．效力檢查 對典型的新城疫病雞和傳染性法氏囊炎病雞，肌肉或皮下注射1ml，3天內應有80％以上明顯好轉或痊癒。
內容來源:多克隆抗體技術