CRISPR
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）全称为“成簇的规律间隔的短回文重复序列”，本是细菌抵御病毒入侵的适应性免疫系统。2012年，科学家发现利用 Cas9 核酸酶和向导 RNA（sgRNA）可实现对 DNA 的定点切割，从而将其转化为革命性的基因编辑工具。在细胞治疗领域，CRISPR 是制造通用型CAR-T（敲除 TRAC/B2M）和下一代增强型细胞药物（敲除 PD-1）的标准生产工具，因其高效、廉价且支持多重编辑（Multiplexing）而获得 2020 年诺贝尔化学奖。
[Image of CRISPR-Cas9 mechanism of action]
作用机制：断裂与修复
CRISPR/Cas9 的工作流程可以概括为“寻找-锁定-切割-修复”，其最终的基因编辑效果取决于细胞随后的 DNA 修复途径：
- 双链断裂 (DSB)： 在 sgRNA 的引导下，Cas9 蛋白识别基因组中特定的 PAM 序列（通常是 NGG），并解开 DNA 双螺旋，精确切断两条 DNA 链，造成 DSB。
- NHEJ（非同源末端连接）： 细胞最常用的应急修复机制。它直接将断裂端强行连接，常引入随机的插入或缺失（InDels），导致移码突变。
应用： 这是制造 UCAR-T 时敲除 TRAC 或 B2M 基因的主要原理。 - HDR（同源重组修复）： 如果同时提供一个外源的 DNA 模板（Template），细胞会以此为蓝本进行精确修复。
应用： 用于实现基因敲入（Knock-in），例如将 CAR 基因定点插入到 TRAC 位点，利用内源启动子调控 CAR 的表达。
基因编辑工具三代演进对比
| 特性 | ZFNs (第一代) | TALENs (第二代) | CRISPR/Cas9 (第三代) |
|---|---|---|---|
| 识别分子 | 蛋白质 (锌指蛋白) | 蛋白质 (TALE蛋白) | RNA (sgRNA) |
| 设计难度 | 极高 (蛋白工程复杂) | 中等 | 极低 (只需合成RNA) |
| 多重编辑能力 | 困难 | 困难 | 卓越 (可同时敲除多基因) |
| 临床代表作 | HIV (CCR5 敲除) | 首例 UCAR-T (Qasim等) | 主流 UCAR-T, 镰刀型贫血 |
临床应用挑战：脱靶效应
尽管 CRISPR 极其强大，但其在临床转化中的最大安全隐患是脱靶效应（Off-target effects）：
- 定义： Cas9 有时会在基因组中序列相似的非目标位置进行切割，可能导致抑癌基因突变或激活原癌基因。
- 染色体易位： 在制造 UCAR-T 时，若同时切割 TRAC 和 B2M 两个位点，产生的两个 DSB 可能发生错误连接，导致染色体大片段的易位或重排。这是 FDA 对多重编辑产品监控的重点。
- 解决方案： 开发高保真 Cas9 变体，或使用不产生双链断裂的碱基编辑（Base Editing）和先导编辑（Prime Editing）技术。
参考文献与学术点评
[1] Jinek M, Doudna J A, Charpentier E, et al. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science.
[学术点评]：诺贝尔奖获奖论文，首次证明了 Cas9 可以在体外被编程切割任意 DNA 序列，开启了基因编辑的新时代。
[2] Stadtmauer E A, et al. (2020). CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science.
[学术点评]：美国首个 CRISPR 编辑 T 细胞的人体临床试验，证实了敲除 TRAC 和 PD-1 的 T 细胞在人体内的安全性，未发现严重的脱靶毒性。
[3] Cong L, Zhang F, et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science.
[学术点评]：张锋团队的开创性工作，首次实现了 CRISPR 在哺乳动物细胞中的应用，并展示了其强大的多重编辑能力。