PAM
PAM（Protospacer Adjacent Motif，原间隔序列邻近基序）是靶向 DNA 序列下游紧邻的一段短核苷酸序列（通常为 2-6 bp），它是 CRISPR/Cas9 系统识别并切割 DNA 的先决条件。Cas9 蛋白必须首先结合 PAM，才能启动 DNA 双链的解旋并与 sgRNA 进行配对。如果靶位点附近没有特定的 PAM 序列，即使 sgRNA 完美互补，Cas9 也无法进行切割。在基因编辑应用中，PAM 的类型（如 NGG）直接限定了可编辑的基因组范围（Targeting Range），是设计 sgRNA 时的首要考量因素。
分子机制：Cas9 的“搜索引擎”
Cas9 蛋白并非随机结合 DNA，而是像搜索引擎的爬虫一样，通过识别 PAM 序列来定位目标：
- 第一步：搜寻与锚定。 Cas9-sgRNA 复合物在基因组 DNA 上快速滑动，通过蛋白内部的精氨酸基团（Arginine residues）特异性识别并结合 PAM 序列（如 NGG）。
- 第二步：解旋与验证。 PAM 的结合触发 Cas9 构象改变，使其解开 PAM 上游的 DNA 双螺旋。随后，sgRNA 开始与 DNA 链进行碱基互补配对（R-Loop 形成）。只有当“种子区”（Seed Region）完美匹配时，Cas9 才会激活核酸酶活性进行切割。
- 第三步：避免自杀。 在细菌自身的 CRISPR 阵列中，间隔序列（Spacer）虽然与病毒序列一致，但其下游没有 PAM 序列。因此，Cas9 永远不会切割细菌自身的基因组，这是一种精妙的免疫耐受机制。
不同核酸酶的 PAM 限制与突破
| 核酸酶类型 | PAM 序列 (5'→3') | 特征与应用 |
|---|---|---|
| SpCas9 (经典) | NGG | 最常用，但在富含 AT 的区域难以找到靶点。 |
| SaCas9 (金葡菌) | NNGRRT | 蛋白极小，适合 AAV 包装，但 PAM 限制更严。 |
| Cas12a (Cpf1) | TTTV | PAM 位于靶点 5' 端，适合富含 AT 的基因组区域。 |
| SpRY (工程化) | NRN / NYN (近乎无PAM) | 打破了 PAM 限制，实现全基因组可编辑 (Genome-wide accessible)。 |
对治疗性编辑的影响
在开发基因疗法（特别是碱基编辑和先导编辑）时，PAM 的位置至关重要：
- 编辑窗口（Editing Window）： 碱基编辑器（Base Editor）只能修饰距 PAM 特定距离（通常是 13-17 bp）内的碱基。如果致病突变附近没有合适的 PAM，就无法进行修复。
- 变体开发： 为了解决“可及性”问题，David Liu 等团队开发了识别 NG、GAA 等非经典 PAM 的 Cas9 变体，使得实际上几乎所有的人类遗传突变都在可编辑范围内。
参考文献与学术点评
[1] Sternberg S H, et al. (2014). DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature.
[学术点评]：揭示了 Cas9 识别 DNA 的三维结构变化，证明了 PAM 结合是 DNA 解旋和 RNA 链入侵（Strand Invasion）的绝对前提。
[2] Kleinstiver B P, et al. (2015). Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature.
[学术点评]：Keith Joung 团队通过定向进化改造了 Cas9，使其能识别 VQR、EQR 等非经典 PAM，显著扩展了 CRISPR 的工具箱。
[3] Walton R T, et al. (2020). Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science.
[学术点评]：报道了 SpRY 变体，几乎完全摆脱了 PAM 序列的限制，理论上可以靶向基因组的任何位点。