CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated protein 9）是生物医学史上最具革命性的基因组编辑技术。该系统源自细菌和古菌的适应性免疫机制，被科学家改造为一种可编程的“分子手术刀”，能够以极高的精度、效率和低廉的成本在活细胞 DNA 上进行搜索、切割和修饰。2012 年，Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 揭示了其生化原理，并因此荣获 2020 年诺贝尔化学奖；而 张锋 (Feng Zhang) 等人则在 2013 年率先攻克了将其应用于哺乳动物（人类）细胞的技术壁垒，开启了基因治疗的新纪元。
技术原理：定位、剪切与修复
CRISPR/Cas9 系统的工作流程可以概括为“GPS导航 + 剪刀切割”，其特异性由 RNA 决定。
| 步骤 | 机制描述 | 关键要素 |
|---|---|---|
| 1. 识别 (Targeting) | sgRNA 携带一段约 20nt 的向导序列，与目标 DNA 进行碱基互补配对。 | RNA-DNA 配对 |
| 2. 锁定 (Locking) | Cas9 蛋白识别目标 DNA 旁边的 PAM序列 (NGG)。这是“保险栓”，防止 Cas9 错误切割自身。 | PAM (NGG) |
| 3. 切割 (Cleavage) | Cas9 的 HNH 和 RuvC 结构域激活，切断 DNA 双链，造成 双链断裂 (DSB)。 | 分子剪刀 |
| 4. 结局 (Outcome) |
• NHEJ (非同源末端连接)： 易出错，导致插入/缺失，实现基因敲除。 |
敲除 vs 敲入 |
历史与争议：诺奖与张锋的贡献
科学发现 vs 技术发明
CRISPR 的历史是“基础科学”与“工程应用”接力的典型案例。
- 2012年 (科学原理)： Doudna & Charpentier 在《Science》发表论文，首次在试管中（体外）证明了 Cas9 是一个双 RNA 引导的 DNA 切割酶，并成功将其简化为单链 sgRNA 系统。这确立了 CRISPR 作为基因编辑工具的理论基础，因此获得 2020 年诺贝尔奖。
- 2013年 (工程突破)： 张锋 (Feng Zhang) 和 George Church 分别在《Science》发表论文，首次证明 CRISPR/Cas9 可以在哺乳动物（人类）细胞中工作。
张锋的关键贡献： 他通过添加核定位信号 (NLS) 解决了 Cas9 进入细胞核的难题，并通过密码子优化解决了细菌蛋白在人类细胞中表达量低的问题。这被视为将“科学原理”转化为“实用技术”的关键一步。
专利双雄：谁拥有 CRISPR？
虽然诺贝尔奖授予了原理发现者，但商业战场上的专利权之争更为复杂。美国专利局（USPTO）最终裁定：
• Broad 研究所（张锋）： 拥有在真核细胞（包括人类）中使用 CRISPR 的专利权。这是目前药物研发和基因治疗中最具商业价值的部分。
• 加州大学（Doudna/Charpentier）： 拥有 CRISPR 技术的基础化学原理专利。
这意味着，任何针对人类疾病的 CRISPR 疗法开发，通常都需要获得张锋团队的专利授权。
🚀 技术演进：从 Cas9 到“超精准”编辑
为了克服 Cas9 的脱靶效应和只能“切断”的局限，张锋及 David Liu 等科学家开发了新一代工具：
- 单碱基编辑 (Base Editing)： 不切断双链，直接将 C 变为 T，或 A 变为 G，治疗单点突变疾病。
- 引导编辑 (Prime Editing)： "搜索与替换"技术，可精确插入或删除任意 DNA 片段。
- Cas12/Cas13： 张锋团队开发的靶向 DNA (Cas12) 和 RNA (Cas13) 的新系统，后者衍生出了 SHERLOCK 检测技术。
学术参考文献
[1] Jinek M, et al. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-821.
[诺奖文献]：Doudna/Charpentier 首次揭示 Cas9 切割机制，奠定理论基础。
[2] Cong L, ..., Zhang F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819-823.
[应用突破]：张锋团队首次证明 CRISPR 可用于人类细胞编辑，确立了其在医学领域的应用地位。
[3] Urnov FD. (2024). CRISPR–Cas9 gene editing for sickle cell disease. Nature. 2024.
[临床里程碑]：评论全球首款 CRISPR 药物 Casgevy 的获批，标志着该技术正式进入临床治疗时代。