三代测序

三代测序 (TGS)

三代测序核心平台：单分子实时测序与纳米孔测序
全称	Third-Generation Sequencing
核心特征	单分子、长读段 (Long-read)
典型技术	PacBio SMRT, ONT Nanopore
临床优势	结构变异、全长转录组、修饰检测

三代测序（Third-Generation Sequencing, TGS），又称单分子测序（Single-molecule Sequencing）或长读段测序（Long-read Sequencing），是继 Sanger 测序（一代）和大规模并行测序（NGS，二代）之后的最新基因组学技术。其核心突破在于能够直接对单个 DNA 或 RNA 分子进行测序，无需 PCR 扩增，从而消除了扩增偏好性。

三代测序以其超长的读段长度（平均 >10 kb，最高可达 Mb 级别）著称，这使得它在复杂基因组区域的从头组装（De novo assembly）、大尺度结构变异（SV）识别以及高度多态性基因家族（如 HLA分型）的解析中展现出显著优势。此外，该技术还支持直接检测 DNA/RNA 的表观遗传修饰。

核心技术路径

目前主流的三代测序技术分为两大技术路径，各自具有独特的物理学逻辑：

   单分子实时测序 (SMRT) —— 荧光脉冲信号
   |
   纳米孔测序 (Nanopore) —— 电流阻断信号

临床应用特征客观评估

基于目前基因组学临床应用规范，三代测序（TGS）与二代测序（NGS）的对比及技术特征如下。

三代测序临床应用特征分析

评估维度	临床客观表现与技术特征
读段长度优势	TGS 读段可跨越重复序列和复杂的结构变异区。这在解析大型倒位、易位及高度重复区域（如端粒、着丝粒）时具有二代测序无法比拟的完整性。
表观遗传检测	无需进行重亚硫酸盐转化（Bisulfite conversion），通过分析碱基通过纳米孔时的电流波动或聚合酶动力学特征，即可直接识别 5mC, 6mA 等修饰。
全长转录组分析	能够直接测定全长 cDNA 或 RNA 分子。这彻底解决了 NGS 在剪接异构体（Isoform）判读中依赖拼接算法的痛点，显著提升了精准分型的维度。
准确度与成本	虽然单次测序原始误差率曾高于 NGS，但通过 PacBio HiFi 模式（多次周回测序）已达到 >99.9% 准确度。目前其主要局限在于单位碱基成本仍高于大规模 Illumina 平台。

核心关联概念

• **NGS (二代测序)**：目前临床通量最高、成本最低的技术，主要用于 SNV 和 Indel 检测。
• **HLA分型 (HLA Typing)**：三代测序的长读段能够直接区分同源染色体上的等位基因，是实现 6 位/8 位高分辨配型的利器。
• **融合基因 (Gene Fusion)**：TGS 能够跨越融合断裂点，直接观察全长融合转录本，提高诊断准确性。
• **液体活检 (Liquid Biopsy)**：利用 TGS 监测 ctDNA 的片段化模式及甲基化图谱。

参考文献

• [1] Eid J, et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009.
• [2] Jain M, et al. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology, 2016.
• [3] Logsdon GA, et al. The structure, function and evolution of a complete human chromosome 8. Nature, 2021. (三代测序完成 T2T 组装).
• [4] 临床高通量及单分子测序技术规范（2025 修订版）：三代测序平台在遗传病与肿瘤学中的应用专家共识。
• [5] Amarasinghe SL, et al. Opportunities and challenges in long-read sequencing data analysis. Genome Biology, 2020.

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