3 產品名稱
通用名稱：H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
英文名稱：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA （PCR-Fluorescence Probing）
5 預期用途
流感病毒可分爲甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依據流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分爲1-16種亞型，根據病毒神經氨酸酶蛋白（NA）的不同可分爲1-9種亞型，HA不同亞型可以與NA的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒。而禽類特別是水禽是所有這些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一種。H7N9流感病毒既可以感染禽類，也可以感染人。人感染H7N9禽流感會出現嚴重肺炎，症狀包括髮燒、咳嗽、呼吸困難等。
本試劑盒適用於檢測呼吸道樣本、血清、肺組織等樣本中H7N9禽流感病毒RNA，可用於該病毒感染的實驗室診斷和宿主動物的監控。檢測結果僅供研究，不用於臨牀診斷。
6 檢驗原理
本試劑盒基於實時熒光PCR技術，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區作爲擴增靶區域，設計特異性引物探針，通過一步法實時熒光PCR體系擴增對H7N9禽流感病毒進行定性檢測。反應體系中除特異性引物和特異性熒光探針外，還配以對應的PCR反應Buffer、逆轉錄酶、Hot-StartTaq酶、核苷酸單體（dNTPs）、Mg2+等成分，可實現對H7N9禽流感病毒核酸靈敏特異地檢測。
9 適用儀器
ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等熒光定量PCR儀。
11 檢驗方法
1.核酸提取
建議取200µl液態樣本進行核酸提取；組織樣本可以研磨液進行提取操作。可採用中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸提取試劑盒，請按照試劑盒介紹進行操作；也可選擇其他合適的商業化產品。本試劑盒中的內標溶液參與提取過程，若提取試劑盒中未說明內標的使用方法可在每200µl樣本中加入4µl內標溶液後進行核酸提取。
本試劑盒中的陰性質控品參與提取，用於對環境進行監控；AIV H7N9陽性質控品不參與提取，用於PCR檢測試劑的質控。
2.PCR擴增（ABI 7500儀器操作爲例，ABI 7300、LC480等儀器參照此操作及儀器操作手冊）
2.1分別配製AIV H7 RT-PCR反應體系和AIV N9 RT-PCR反應體系
取適量PCR反應管（按AIV H7反應體系計算）；每管加入AIV H7 PCR反應液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應液B 3µl（也可按照單個反應的用量，計算PCR反應液A、B各自所需總量，兩者混勻後分裝20µl於單個PCR反應管中）。
取適量PCR反應管（按AIV N9反應體系計算）；每管加入AIV N9 PCR反應液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應液B 3µl（也可按照單個反應的用量，計算PCR反應液A、B各自所需總量，兩者混勻後分裝20µl於單個PCR反應管中）。
2.2於上述PCR反應管中分別加入處理後的陰性質控品、AIV H7N9陽性質控品、待測標本核酸各5µl，8,000rpm離心數秒，放入PCR擴增儀。
2.3探針檢測模式設置爲：Reporter Dye1：FAM，QuencherDye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反應條件設置爲：50℃ 15min，1個循環；95℃ 15分鐘，1個循環；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集熒光），45個循環。保存文件，運行。
3.結果分析
3.2 分析條件設置：根據分析後圖像調節Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用戶可根據實際情況自行調整，Start值可以在3～15、End值可設在5～20，調整陰性對照的擴增曲線平直或低於閾值線），點擊Analysis自動獲得分析結果，在Report界面察看結果。
12 質量控制】
陰性質控品：FAM檢測通路擴增曲線無對數增長期，VIC檢測通路擴增曲線爲明顯對數增長期；
陽性質控品：FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數增長期，且FAM檢測通道擴增曲線 Ct值≤32；
以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。
13 結果判定
1.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應體系FAM檢測通道均無擴增曲線或Ct值＞40，且在VIC檢測通道均有對數增長期，可判樣品爲H7N9禽流感病毒陰性；
2.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應體系擴增曲線在FAM,VIC檢測通道均有對數增長期且FAM檢測通道Ct值≤40；可判樣品爲H7N9禽流感病毒陽性；
3.如果檢測樣品的AIV H7或N9 RT-PCR反應體系僅其中之一的擴增曲線滿足判爲陽性的要求，則需重複檢測；若重複檢測結果爲H7及N9均陽性，則判H7N9禽流感病毒陽性；若重複檢測結果仍爲H7（或N9）陽性，則只能判禽流感病毒H7（或N9）亞型陽性，並建議以其他方法做進一步確認。
14 檢測方法的侷限性
4.由於不同提取方法的原理不同，採用不同核酸提取試劑進行樣本處理時核酸提取效率存在一定差異，本試劑盒推薦使用本公司生產的核酸提取試劑盒（離心柱法），用戶可根據具體要求進行選擇確認。
15 產品性能指標
根據產品分析性能評估結果，本試劑盒的分析靈敏度爲1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染症狀相似的其他病原體（甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒H1亞型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亞型病毒、禽流感H9亞型病毒等）無交叉反應。
16 注意事項
1.實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規範，實驗人員必須進行專業培訓，實驗過程嚴格分區進行（試劑準備區、標本製備區、擴增和產物分析區），所用消耗品應滅菌後一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段用品不能交叉使用；
2.爲試劑和標本準備階段提供生物安全櫃，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；
3.試劑使用前要完全解凍，8,000rpm離心數秒後使用；
4.標本製備區所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，並與廢棄物一起滅菌後方可丟棄；
5.實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外線燈處理工作臺和移液器；
6.本試劑盒內陽性質控品應視爲具有傳染性物質，操作和處理均需符合相關法規要求：衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》。
17 生產企業
企業名稱：中山大學達安基因股份有限公司
生產地址：廣州市高新技術產業開發區香山路19號；廣州市高新技術產業開發區荔枝山路6號
郵 編：510665
電 話：020-32290789、8008304008
傳 真：020-32068820
網 址：http://www.daangene.com
18 醫療器械生產企業許可證編號
粵食藥監械生產許20040999號