1 拼音
W S / T 7 9 9 — 2 0 2 2 wū shuǐ zhōng xīn xíng guān zhuàng bìng dú fù jí nóng suō hé hé suān jiǎn cè fāng fǎ biāo zhǔn
3 基本信息
ICS 13.060
CCS C 51
中華人民共和國衛生行業標準《WS/T 799—2022 污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準》（Method for enrichment and nucleic acid detection of SARS-CoV-2 in sewage）由中華人民共和國國家衛生健康委員會於2022年03月24日《關於發佈推薦性衛生行業標準《污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準》的通告》（國衛通〔2022〕5號）發佈，自2022年03月24日起實施。
4 發佈通知
關於發佈推薦性衛生行業標準《污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準》的通告
國衛通〔2022〕5號
現發佈推薦性衛生行業標準《污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準》，編號和名稱如下：
WST799—2022污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準
該標準自發布之日起施行。
特此通告。
國家衛生健康委
2022年3月24日
5 前言
本標準由國家衛生健康委環境健康標準專業委員會負責技術審查和技術諮詢，由中國疾病預防控制中心衛生標準處負責協調性和格式審查，由國家衛生健康委員會疾控局負責業務管理、法規司負責統籌管理。
本標準起草單位：中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所、清華大學、中國科學院生態環境研究中心、中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所。
本標準主要起草人：張嵐、唐宋、黃霞、楊敏、張曉、張良、王園媛、劉豔臣、田哲、段招軍。
6 正文
6.1 1 範圍
本標準適用於生活污水、醫療機構污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測。
6.2 2 規範性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規範性引用而構成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用於本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本標準。
WS/T 697 新冠肺炎疫情期間特定人羣個人防護指南
6.3 3 術語和定義
下列術語和定義適用於本標準。
新型冠狀病毒 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2屬於β屬冠狀病毒，基因組爲線性單股正鏈的RNA病毒，全長約30 kb，有包膜，呈圓形或橢圓形顆粒狀，直徑爲60 nm～140 nm。
Ct 值 cycle threshold
在實時熒光定量PCR中，每個反應體系中的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。
實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應 real-time fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction
在反轉錄DNA聚合酶鏈式反應的擴增反應中加入熒光化學物質，通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測實現對起始模板定量及定性的分析方法。
6.4 4 檢出限
富集濃縮採用聚乙二醇沉澱法或鋁鹽混凝沉澱法時，方法檢出限爲10 copies/mL；富集濃縮採用離心超濾法時，方法檢出限爲100 copies/mL。
6.5 5 水樣的採集、運輸及保存
根據採樣場所排水系統分佈情況，重點選取污水排水口、內部管網彙集處等關鍵位置對未經消殺處理的污水進行採樣。用無菌聚乙烯瓶採集污水樣本，採樣體積爲300 mL。可根據現場條件和檢測需求確定水樣採集方式，如瞬時水樣（採樣點位某一時間隨機採集的樣本）或混合水樣（同一採樣點位不同時間所採集的瞬時水樣混合後的樣本）。樣本採集後應在現場使用75 %酒精對採樣瓶外表面進行消毒，然後將採樣瓶裝入密封採樣袋中，對密封採樣袋外表面再次進行消毒，並儘快將樣本送至實驗室，運輸過程中確保0 ℃～4 ℃條件下冷藏運輸。到達實驗室後樣本同樣應保存於0 ℃～4 ℃環境中，實驗室應在接到樣本後24 h內進行富集濃縮處理，並在富集濃縮後24 h內完成核酸提取及實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應（實時熒光RT-PCR）檢測。
6.6 6 病毒滅活
將樣本充分混勻後置於60 ℃水浴30 min。
6.7 7 病毒富集濃縮
注：本部分中三種新型冠狀病毒富集濃縮方法適用條件相同，使用過程中可根據實驗條件進行選擇。
6.7.1 7.1 聚乙二醇沉澱法
6.7.1.1 7.1.1 原理
向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定鹽濃度條件下可使病毒顆粒形成多聚體，在一定離心力下將水溶液與病毒顆粒多聚體分開，收集病毒顆粒多聚體形成的沉澱，用於後續核酸提取和實時熒光RT-PCR檢測。
6.7.1.2 7.1.2 試劑和材料
7.1.2.1 試劑
7.1.2.1.1 聚乙二醇：分子生物學級，平均分子量 8 000。
7.1.2.2 材料
7.1.2.2.1 無菌帶蓋離心管：1.5 mL，無核酸酶；50 mL 或 250 mL，可承受離心力≥12 000 g。
7.1.2.2.2 無菌移液器吸頭：1 mL，帶濾芯，無核酸酶。
7.1.2.2.3 無菌移液管：50 mL。
6.7.1.3 7.1.3 儀器設備
7.1.3.1 高速冷凍離心機：4 ℃，50 mL 或 250 mL 轉子，可承受離心力≥12 000 g。
7.1.3.2 電子天平：分辨力不低於 0.001 g。
7.1.3.3 生物安全櫃：II 級或 II 級以上。
7.1.3.4 高壓滅菌器。
7.1.3.5 移液器：1 mL。
7.1.3.6 大容量電動移液器。
6.7.1.4 7.1.4 富集濃縮步驟
7.1.4.1 預離心
用大容量電動移液器分別移取3份35 mL污水樣本置於3個50 mL離心管中，在4 ℃、2 500 g條件下離心30 min，將上清液分別轉移到另外3個50 mL離心管中備用。剩餘污水樣本作爲備份。
注1：當污水樣本懸浮物含量過高，可能影響病毒核酸提取和實時熒光RT-PCR檢測時，應採用預離心棄除懸浮物後再進行後續操作。
注2：若選用250 mL離心管，可直接取105 mL污水樣本於250 mL離心管中，在上述條件下離心後將上清液轉移到另外1個250 mL離心管中備用。
7.1.4.2 第二次離心
在3個裝有35 mL污水樣本或預離心後上清液的50 mL離心管中分別加入3.5 g±0.1 g聚乙二醇和0.79 g±0.01 g氯化鈉，充分混合，直至試劑完全溶解，該溶解過程約需15 min。然後在4 ℃、12 000 g條件下離心120 min，離心機降速時不應使用制動力。離心機停止後傾倒並棄除離心管中的上清液，至無上清液流出。
注：若選用250 mL離心管，在裝有105 mL污水樣本或預離心後上清液的250 mL離心管中操作時，聚乙二醇和氯化鈉用量應等比例增加，其他操作相同。
7.1.4.3 富集濃縮
7.1.4.3.1 在 4 ℃、12 000 g 條件下將第二次離心後剩餘的樣本再次離心 5 min，離心機降速時不應使用制動力。離心機停止後用移液器從離心管中吸出並棄除剩餘的上清液。
7.1.4.3.2 吸取 0.4 mL 無核酸酶水加入到其中的一個離心管中，反覆吹吸沉澱，瞬時離心，使所有液體聚集在管底，將混懸液吸出並加入到第二個離心管中。
7.1.4.3.3 重複吹吸沉澱和瞬時離心的操作後，再次將混懸液吸出並加入到第三個離心管中。
7.1.4.3.4 繼續重複吹吸沉澱和瞬時離心的操作，最終形成的混懸液即爲該水樣的濃縮液，體積約爲0.6 mL。將濃縮液轉移至 1.5 mL 離心管中，於 0 ℃～4 ℃條件下保存，並於 24 h 內完成核酸提取和實時熒光 RT-PCR 檢測。
注：若選用250 mL離心管，按照7.1.4.3.1條件再次離心並棄除剩餘的上清液後，在離心管中加入0.4 mL無核酸酶水，反覆吹吸沉澱，並瞬時離心後即得到濃縮液。
6.7.2 7.2 鋁鹽混凝沉澱法
6.7.2.1 7.2.1 原理
向污水中加入鋁鹽混凝劑，鋁鹽水解產生的氫氧化鋁膠體可吸附和包裹病毒顆粒，通過離心作用收集含病毒的膠體，然後通過化學溶解釋放出包裹的病毒顆粒，用於後續核酸提取和實時熒光RT-PCR檢測。
6.7.2.2 7.2.2 試劑和材料
7.2.2.1 試劑
7.2.2.1.1 實驗用水：GB/T 6682 規定的一級水。
7.2.2.1.2 氯化鋁溶液[c（AlCl3）=0.3 mol/L]：稱取 4 g 無水氯化鋁（純度≥99 %），置於燒杯中，加入 100 mL 水，攪拌溶解後轉移至試劑瓶中。
7.2.2.1.3 氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=1 mol/L]：稱取 4 g 氫氧化鈉（純度≥96 %），置於燒杯中，加入100 mL 水，攪拌溶解後轉移至試劑瓶中。
7.2.2.1.4 鹽酸溶液[c（HCl）=1 mol/L]：移取 43 mL 鹽酸（分析純，ρ20=1.19 g/mL）於燒杯中，加入適量水，用玻璃棒攪拌混勻後轉移至 500 mL 容量瓶中，並定容至刻度。
7.2.2.1.5 乙二胺四乙酸二鈉二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）：純度≥98 %。
7.2.2.2 材料
7.2.2.2.1 無菌螺口錐形瓶：100 mL。
7.2.2.2.2 無菌帶蓋離心管：10 mL、50 mL。
7.2.2.2.3 無菌移液器吸頭：200 μL、1 mL，帶濾芯，無核酸酶。
7.2.2.2.4 無菌移液管：50 mL。
6.7.2.3 7.2.3 儀器設備
7.2.3.1 冷凍離心機：4 ℃，50 mL 轉子，可承受離心力≥2 500 g。
7.2.3.2 恆溫振盪培養箱。
7.2.3.3 電子天平：分辨力不低於 0.001 g。
7.2.3.4 pH 計：精度≥0.01。
7.2.3.5 水浴鍋。
7.2.3.6 生物安全櫃：II 級或 II 級以上。
7.2.3.7 高壓滅菌器。
7.2.3.8 移液器：200 μL、1 mL。
7.2.3.9 大容量電動移液器。
6.7.2.4 7.2.4 富集濃縮步驟
7.2.4.1 預離心
取大於50 mL的污水樣本在4 ℃、2 500 g條件下離心30 min，留取上清液備用。剩餘污水樣本作爲備份。
注：當污水樣本懸浮物含量過高，可能影響病毒核酸提取和實時熒光RT-PCR檢測時，應採用預離心棄除懸浮物後再進行後續操作。
7.2.4.2 富集濃縮
7.2.4.2.1 絮凝處理
用大容量電動移液器將50 mL污水樣本或預離心後的上清液轉移至100 mL螺口錐形瓶中，加入0.5 mL0.3 mol/L的氯化鋁溶液，用1 mol/L氫氧化鈉溶液或1 mol/L鹽酸溶液調節水樣pH=6.0±0.1。將螺口錐形瓶蓋擰緊，置於恆溫振盪培養箱中，以150 r/min的速度在室溫下混合15 min。
將水樣轉移至50 mL離心管中，在4 ℃、1 900 g條件下離心5 min。
7.2.4.2.3 絡合溶解
傾倒棄除離心管中的上清液，在剩餘膠體中加入0.20 g±0.01 g乙二胺四乙酸二鈉二水合物，搖晃數十次至膠體變爲液態，轉移至10 mL離心管中。將10 mL離心管置於水浴鍋中，60 ℃水浴10 min。水浴後離心管中的液體即爲該水樣的濃縮液，體積約爲1 mL，於0 ℃～4 ℃條件下保存，並於24 h內完成核酸提取和實時熒光RT-PCR檢測。
6.7.3 7.3 離心超濾法
6.7.3.1 7.3.1 原理
選用嵌有超濾膜的超濾杯，通過離心作用將分子量大於超濾膜截留分子量的病毒顆粒截留在超濾杯內，收集超濾杯中的病毒濃縮液，用於後續核酸提取和實時熒光RT-PCR檢測。
6.7.3.2 7.3.2 材料
7.3.2.1 一次性超濾杯：截留分子量爲 30 kDa，體積爲 70 mL，可倒置離心回收樣本。
7.3.2.2 無菌帶蓋離心管：2 mL，無核酸酶；50 mL。
7.3.2.3 無菌移液器吸頭：1 mL，帶濾芯，無核酸酶。
7.3.2.4 無菌移液管：50 mL。
6.7.3.3 7.3.3 儀器和設備
7.3.3.1 冷凍離心機：4 ℃，50 mL 轉子，可承受離心力≥6 000 g。
7.3.3.2 冷凍離心機：4 ℃，250 mL 水平轉子，可承受離心力≥3 000 g。
7.3.3.3 生物安全櫃：II 級或 II 級以上。
7.3.3.4 高壓滅菌器。
7.3.3.5 移液器：1 mL。
7.3.3.6 大容量電動移液器。
6.7.3.4 7.3.4 富集濃縮步驟
7.3.4.1 預離心
7.3.4.1.1 用大容量電動移液器移取 50 mL 污水樣本於 50 mL 離心管中，在 4 ℃、5 000 g 條件下離心30 min，分別保留上清液和沉澱物。剩餘污水樣本作爲備份。
7.3.4.1.2 取 0.5 mL 上清液加入到保留沉澱物的離心管中，將沉澱物重懸混勻，保留待用。
7.3.4.2 富集濃縮
7.3.4.2.1 超濾杯前處理：取 30 mL 無菌水加入到樣品濃縮杯中，使用水平轉子在 4 ℃、2 480 g 條件下離心 10 min，棄除濾液收集杯中的濾出液，再將樣品濃縮杯反向倒置在濃縮液收集杯上，在 4 ℃、920 g 條件下離心 3 min，棄除收集液。
7.3.4.2.2 將 7.3.4.1.1 預離心得到的上清液轉移至樣品濃縮杯中，使用水平轉子在 4 ℃、2 480 g 條件下離心 15 min。如樣品濃縮杯中殘留液體體積較大，可適當延長離心時間，直至濃縮杯中液體約爲 0.3 mL～0.6 mL。
7.3.4.2.3 待全部上清液濃縮完成後，將樣品濃縮杯反向倒置在濃縮液收集杯上，在 4 ℃、920 g 條件下離心 3 min，吸取濃縮液收集杯中的液體，轉移至 2 mL 離心管中。
7.3.4.2.4 吸取 7.3.4.1.2 預離心得到的沉澱物混懸液 0.5 mL，與 7.3.4.2.3 中得到的液體混合，即爲該水樣的濃縮液，體積約爲 0.8 mL～1.1 mL，於 0 ℃～4 ℃條件下保存，並於 24 h 內完成核酸提取和實時熒光 RT-PCR 檢測。
注1：也可選用截留分子量爲100 kDa的超濾杯，但對應離心濃縮時離心力不宜超過3 000 g；
注2：也可選用不帶倒置離心功能的超濾杯，但在完成7.3.4.2.2後，7.3.4.2.3應改爲“待全部上清液濃縮完成後，取下樣品濃縮杯，用移液器吸取濃縮液體小心吹打膜數次後，吸取所有濃縮液並轉移至2 mL離心管中”。
6.8 8 核酸檢測
6.8.1 8.1 核酸提取
6.8.1.1 8.1.1 試劑和材料
8.1.1.1 試劑
8.1.1.2 材料
8.1.1.2.1 無菌帶蓋離心管：1.5 mL，無核酸酶。
8.1.1.2.2 無菌移液器吸頭：10 μL、200 μL、1 mL，帶濾芯，無核酸酶。
6.8.1.2 8.1.2 儀器和設備
8.1.2.1 生物安全櫃：II 級或 II 級以上。
8.1.2.2 高壓滅菌器。
8.1.2.3 移液器：10 μL、200 μL、1 mL。
6.8.1.3 8.1.3 核酸提取步驟
在生物安全櫃中打開裝有污水樣本濃縮液的離心管，按照病毒核酸提取試劑盒說明，取適量濃縮液進行核酸提取，提取完成後應立即封蓋並馬上進行實時熒光RT-PCR檢測。剩餘的濃縮液和核酸樣本應於-80 ℃條件下凍存。
6.8.2 8.2 實時熒光 RT-PCR 檢測
6.8.2.1 8.2.1 試劑和材料
8.2.1.1 試劑
8.2.1.1.1 新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）。
8.2.1.2 材料
8.2.1.2.1 無菌移液器吸頭：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL，帶濾芯，無核酸酶。
8.2.1.2.2 無菌 PCR 管或 PCR 板：無核酸酶。
6.8.2.2 8.2.2 儀器和設備
8.2.2.1 實時熒光 PCR 儀。
8.2.2.2 混勻器。
8.2.2.3 生物安全櫃：II 級或 II 級以上。
8.2.2.4 移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL。
6.8.2.3 8.2.3 檢測步驟
8.2.3.1 檢測靶標選擇原則
採用雙靶標檢測，針對開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。必要時可根據檢測需求和相關規定進行調整。
8.2.3.2 反應體系
6.9 9 質量控制
6.9.1 9.1 富集濃縮質量控制
6.9.1.1 9.1.1 富集濃縮陽性質量控制
9.1.1.1 將採集到的污水樣本滅活後，加入污水中不存在的非人源病毒（如：鼠肝炎病毒、牛冠狀病毒、牛呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒假病毒等陽性質控），加標濃度爲 1 000 copies/mL，作爲富集濃縮陽性質控樣。富集濃縮陽性質控樣檢測過程與污水樣本檢測過程完全相同，但實時熒光 RT-PCR 時應使用相應核酸檢測試劑盒。
9.1.1.2 在每一批次檢測中應至少做一個富集濃縮陽性質控樣。
6.9.1.2 9.1.2 富集濃縮陰性質量控制
9.1.2.1 樣本採集時用無核酸酶水代替污水樣本，將其作爲富集濃縮陰性質控樣。富集濃縮陰性質控樣檢測過程與污水樣本檢測過程完全相同。
9.1.2.2 在每一批次檢測中應至少做一個富集濃縮陰性質控樣。
6.9.2 9.2 核酸提取質量控制
6.9.2.1 9.2.1 核酸提取陽性質量控制
9.2.1.1 使用 9.1.1.1 中陽性質控作爲核酸提取過程陽性質控樣。核酸提取陽性質控樣檢測過程與污水樣本從核酸提取開始的檢測過程完全相同，但實時熒光 RT-PCR 時應使用相應核酸檢測試劑盒。
9.2.1.2 在每一批次核酸提取過程中應至少做一個核酸提取陽性質控樣。
6.9.2.2 9.2.2 核酸提取陰性質量控制
9.2.2.1 使用無核酸酶水作爲核酸提取過程陰性質控樣。核酸提取陰性質控樣檢測過程與污水樣本從核酸提取開始的檢測過程完全相同。
9.2.2.2 在每一批次核酸提取過程中應至少做一個核酸提取陰性質控樣。
6.9.3 9.3 PCR 檢測質量控制
6.9.3.1 9.3.1 PCR 檢測陽性質量控制
9.3.1.1 使用新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒中的陽性質控作爲 PCR 檢測過程陽性質控樣。製備反應體系時用 PCR 陽性質控樣代替樣本核酸加入，其他操作與污水樣本 PCR 檢測過程完全相同。
9.3.1.2 在每一批次實時熒光 RT-PCR 過程中應至少做一個 PCR 檢測陽性質控樣。
6.9.3.2 9.3.2 PCR 檢測陰性質量控制
9.3.2.1 使用新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒中的陰性質控作爲 PCR 檢測過程陰性質控樣。製備反應體系時用 PCR 陰性質控樣代替樣本核酸加入，其他操作與污水樣本 PCR 檢測過程完全相同。
9.3.2.2 在每一批次實時熒光 RT-PCR 過程中應至少做一個 PCR 檢測陰性質控樣。
6.10 10 結果與報告
6.10.1 10.1 實驗有效性判斷
實驗結果應滿足表1要求，否則實驗視爲無效。
表1 實驗有效性判斷標準
注：以上6項需在一次實驗中同時滿足。
6.10.2 10.2 結果判定
6.10.2.1 10.2.1 PCR 結果判斷
10.2.1.1 陰性：無 Ct 值、無 S 形擴增曲線。
10.2.1.2 陽性：Ct 值小於或等於新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒介紹規定值，且有 S 形擴增曲線。
注：或以產品介紹爲準。
6.10.2.2 10.2.2 陽性樣本判斷
10.2.2.1 雙靶標：同一份樣本中新型冠狀病毒 2 個靶標（ORF1ab 和 N）實時熒光 RT-PCR 均出現陽性檢測結果，即 2 個靶標的 3 個平行樣各出現至少 1 個陽性檢測結果，樣本判定爲陽性，例如：ORF1ab+/-/-，N -/+/-。
10.2.2.2 單靶標：同一份樣本中新型冠狀病毒單靶標（ORF1ab 或 N）實時熒光 RT-PCR 至少 2 個平行樣出現陽性檢測結果，樣本判定爲陽性，例如：ORF1ab +/+/-，N -/-/-或 ORF1ab -/-/-，N +/+/-。
當出現單個靶標只有 1 個平行樣爲陽性檢測結果時，需對該樣本重新進行富集濃縮和核酸提取，並進行實時熒光 RT-PCR 檢測，若仍出現陽性檢測結果，則樣本判定爲陽性。
6.10.3 10.3 結果報告
根據檢測結果，報告“檢出新型冠狀病毒核酸”或“未檢出新型冠狀病毒核酸”。
6.11 11 實驗室安全
6.11.1 11.1 生物安全
污水樣本採集時個人防護要求應符合WS/T 697相關規定。樣本滅活、檢測等操作應在生物安全二級及以上實驗室進行，同時採用不低於生物安全三級實驗室的個人防護。水樣採集後，富集濃縮、核酸提取和實時熒光RT-PCR檢測等所有操作均應避免樣本暴露於外環境。實驗過程中產生的所有廢棄物（包括剩餘水樣）均應經有效滅菌後再按醫療廢棄物進行分類處理。
